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2024 , Vol. 52 >Issue 5: 55 - 70

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024230

Identification of PsaA/PsaB gene family in tobacco and its response to stress

  • CHANG Yongchun 1 ,
  • YIN Guoying 2 ,
  • YAN Yibo 3 ,
  • GUO Yushuang 2 ,
  • YU Wangjie 4 ,
  • PENG Yihong 5 ,
  • WU Yuxiang , 1, *
Expand
  • 1 College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
  • 2 Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, Guizhou, China
  • 3 Department of Horticulture and Landscape, Zhangzhou City College, Zhangzhou 363000, Fujian, China
  • 4 College of Advanced Agriculture and Ecological Environment, Heilongjiang University, Harbin 150006, Heilongjiang, China
  • 5 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Received date: 2024-01-22

  Online published: 2024-09-27

Fold

Abstract

PsaA and PsaB are central proteins in photosystem Ⅰ, and play important roles in plant photosynthesis and stress regulation. Tobacco (Nicotiana tabacum L.) is a model crop for plant functional genomics research, while there are few studies on the functions of PsaA and PsaB genes. In order to understand the response of tobacco PsaA/PsaB genes to stress, the PsaA/PsaB gene family in tobacco genome were identified, and their physicochemical properties, subcellular localization, phylogenetic evolution, motifs and promoter regulatory elements were analyzed. The results showed that there are 27 PsaA/PsaB genes in tobacco. Compared with Arabidopsis thaliana, the tobacco PsaA/PsaB gene family undergone significant expansion and can be classified into three subfamilies based on their phylogenetic and structural features. The promoters of tobacco PsaA/PsaB genes contain numerous cis-regulatory elements responsive to light, low temperature, drought and plant hormones. RT-qPCR analysis revealed that most tobacco PsaA/PsaB genes were up-regulated under low temperature stress (8 up-regulated genes) and down-regulated under polyethylene glycol and jasmonic acid methyl ester stresses(8 and 7 down-regulated genes respectively). After potato virus Y(PVY) and tobacco mosaic virus (TMV) infection, the expression of most tobacco PsaA/PsaB genes were down-regulated. The down-regulated genes in the lower mesophyll and vein tissues were 19 and 17 after PVY infection, and 9 genes were down-regulated after TMV infection. In conclusion, tobacco PsaA/PsaB genes are involved in the response process of tobacco to various abiotic stresses, and the study results provide a reference for further exploring the role of PsaA/PsaB genes in regulating plant response to stress.

Key words： tobacco; PsaA/PsaB gene family; PEG response; MeJA response; drought stress; low temperature stress; TMV response; PVY response

Cite this article

CHANG Yongchun , YIN Guoying , YAN Yibo , GUO Yushuang , YU Wangjie , PENG Yihong , WU Yuxiang . Identification of PsaA/PsaB gene family in tobacco and its response to stress[J]. Journal of Shaanxi Normal University(Natural Science Edition), 2024 , 52(5) : 55 -70 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024230

光合作用在植物生长发育中扮演重要角色,是植物最基本的生命活动之一。在光合作用中,光系统Ⅰ(photosystem Ⅰ,PSⅠ)和光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ,PSⅡ)是镶嵌在叶绿体类囊体膜上的膜蛋白复合物,参与叶绿体的光反应。植物进行光合作用的过程需要通过PSⅠ和PSⅡ的驱动[1],其中PSⅠ核心复合物(PSⅠ-CC)由反应中心复合体及负责捕光和引导能量的外周天线复合物等亚基组成,包含11~13个多肽和辅助因子[2]。在PSⅠ核心复合物的蛋白亚基中,PsaA和PsaB是最重要的2种蛋白亚基,它们的氨基酸序列和结构具有高度同源性和保守性[3-4],其基因在高等植物环状质体基因组的大单拷贝区域中彼此相邻[5⇓-7]。作为光系统Ⅰ跨膜复合物的中心蛋白,PsaA与PsaB相互结合,在植物光合作用及其他生理过程中共同承担重要生物学功能[8-9]。Smart等[10]发现PSⅠ中PsaA或PsaB基因被卡那霉素抗性基因中断,均会引起PSⅠ复合物在类囊体中缺失;PsaA和PsaB以异源二聚体的形式存在,在整个PSⅠ复合物组装中发挥重要功能。
植物在受到干旱[11]、低温[12]、病害[13]等生物和非生物胁迫后,会引起PSⅠ和PSⅡ结构和功能的损伤,叶绿体形态结构发生变化,光合速率、胞间CO2浓度、叶片气孔导度等光合参数也发生改变[14-15],同时逆境胁迫会影响植物水分和营养的吸收,造成营养亏缺、叶绿素含量下降,最终影响光合作用[16⇓⇓⇓⇓⇓⇓-23]。植物响应逆境胁迫的机理十分复杂,光合作用是植物逆境响应的重要生理过程。由于光合作用的光反应是在类囊体膜上进行的,所以研究植物类囊体膜关键蛋白PsaA和PsaB有助于进一步了解植物光合作用对逆境胁迫的响应机制。烟草作为植物功能基因组学研究的模式植物和我国重要的经济作物之一,是研究植物逆境胁迫响应机理的理想材料。
逆境胁迫下,光系统存在不同程度的响应。研究表明,干旱会诱导类囊体膜重组,大多数干旱胁迫会引起PSⅡ及其天线的响应。Hu等[11]研究发现拟南芥在严重的干旱胁迫下,PSⅠ天线尺寸减小,PSⅠ-LHCI超复合物被降解,虽然没有观察到PSⅠ核心蛋白含量的变化,但PSⅠ的功能受到严重影响,表明非功能性PSⅠ复合物在干旱胁迫时大量积累。He等[24]发现在干旱胁迫下,金银花出现严重的PSⅡ和PSⅠ光抑制,最大光化学效率降低,PSⅠ和PSⅡ反应中心蛋白丰度明显下降。黄瓜在低温弱光胁迫过程中,由于PSⅠ对活性氧(reactive oxygen species,ROS)的敏感性高,以及PSⅠ对幼叶光抑制引起的PSⅡ激发压较高,导致幼叶光系统对低温光的耐受性比完全展开叶降低[12]。禾生指梗霉侵染谷子后,谷子叶片的叶绿素及类胡萝卜素含量均显著下降,PSⅠ、PSⅡ、天线蛋白及细胞色素b6f复合物蛋白编码基因的表达水平降低;禾生指梗霉侵染严重破坏了谷子叶片的光合系统,抑制寄主的抗病防御反应[25]。
PSⅠ反应中心复合体的2种蛋白亚基PsaA和PsaB在逆境胁迫下会有不同程度的响应。Lv等[26]于2019年发现,调节性细胞死亡(regulatory cell death,RCD)表型出现后,类病斑突变体lsd1光合作用相关的核基因(PhANGs)和质体基因(PhAPGs)相关基因显著变化,其中PSⅠ中PsaA和PsaB编码的CI蛋白表达下调后参与了光化学猝灭过程。Cheng等[27]于2021年研究发现,变绿异燕麦在低温胁迫后叶绿素含量下降,叶片的相对电导率上升,编码PSⅠ亚基的PsaA和PsaB基因表达水平明显上调。Das等[28]发现烟草花叶病毒侵染烟草植株过程中,参与光系统和植物防御的主要蛋白发生改变,在光合作用PSⅠ中PsaA和PsbB蛋白的丰度显著降低。在干旱胁迫下,不耐旱水稻品种的光合作用相关基因表达水平下降,导致光系统和光合效率的抑制作用明显加强;而耐旱水稻品种中PsaA等基因上调,通过抑制ROS产生,增强ROS清除能力并提高羧化效率和光合效率,最终提高植株抗旱能力[29]。Xia等[30]于2023年对黄瓜转录组进行分析,探讨了叶绿体基因在低温刺激下的表达变化。与正常温度相比,在低温条件下,PsaA的RNA编辑效率显著降低,进一步影响植物的光合作用能力。此外,PSⅠ的其他蛋白也参与逆境响应,如Jiménez等[13]发现PSⅠ中PsaK蛋白与病毒蛋白互作,李痘病毒(porcine parvovirus,PPV)的CI蛋白与本氏烟(Nicotiana benthamiana)的PsaK基因编码蛋白PSI-K互作,引起PsaK基因下调,导致PPV大量积累。
本研究以PSⅠ中核心蛋白编码基因PsaA和PsaB为研究对象,通过鉴定烟草PsaA/PsaB基因家族成员,对其理化性质、系统进化、Motif基序、启动子调控元件进行分析,并进一步通过RT-qPCR验证烟草PsaA/PsaB基因家族在低温、干旱、植物激素和病毒胁迫中的表达模式,探究PsaA/PsaB基因家族参与调控烟草对逆境胁迫的响应,为明确光系统在植物应对逆境胁迫中的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料:普通栽培烟草K326。
病原微生物:马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)由贵州省烟草科学研究所提供。
试剂:植物RNA纯化试剂盒(ER301-01)、反转录试剂盒(AT311-02)、荧光定量 PCR 试剂盒(TG-AQ601-02)均购自北京全式金生物技术股份有限公司;其他常规试剂均为国产分析纯。
基因组及数据库文件:烟草PsaA/PsaB基因家族数据来源于拟南芥数据库TAIR(https://www.arabidopsis.org)和烟草K326的转录组数据[31];烟草K326的基因组文件来源于Solanaceae Genomics Network数据库(http://ftp.solgenomics.net)和叶绿体基因组数据库CGTR(https://ngdc.cncb.ac.cn/cgir)。

1.2 方法

1.2.1 烟草PsaA/PsaB基因家族的全基因组鉴定

在拟南芥数据库TAIR(https://www.arabidopsis.org)中查询光系统Ⅰ的PsaA和PsaB基因,根据基因号ATCG00350.1(PsaA)和ATCG00340.1(PsaB),下载对应的蛋白质序列。以拟南芥的ATCG00350.1和ATCG00340.1蛋白序列作为种子序列,首先利用TBtools软件的BLAST程序分别对拟南芥和烟草K326的总蛋白序列进行同源蛋白鉴定,在BLAST结果中选取e-value大于1×10-10、score得分大于56的序列作为候选目标序列。进一步在烟草K326 cDNA注释文件“Nitab-v4.5_cDNA_Edwards2017”中筛选注释信息为“Photosystem Ⅰ PsaA/PsaB”的序列,在此基础上,筛选具有完整CDS和2个以上结构域的序列,作为烟草PsaA/PsaB基因家族序列。

1.2.2 烟草PsaA/PsaB基因家族的理化性质分析

将烟草PsaA/PsaB蛋白序列提交到ExPASy网站(https://www.expasy.org),对烟草PsaA/PsaB基因家族成员的蛋白质分子量、等电点等预测分析。在NCBI和叶绿体基因组数据库CGTR(https://ngdc.cncb.ac.cn/cgir)中搜索基因来源于叶绿体基因组或核基因组。利用TBtools软件,从烟草K326 gff注释文件“Nitab-v4.5_gene_models_Chr_Edwards2017”“Nitab-v4.5_gene_models_Scf_Edwards2017”中获取烟草PsaA/PsaB基因在染色体上的位置。

1.2.3 系统进化树构建

利用TBtools软件的Fasta Extract程序提取烟草PsaA/PsaB基因家族成员的蛋白质序列,整理成fasta文件,使用 MEGA11 软件的Alignment-Align by MUSCLE 进行序列比对,选择默认参数,将结果输出为mega format文件。点击Phylogenetic Analysis构建进化树,选择邻接法(neighbor-joining),设置参数Test of Phylogeny为Bootstrap Method,重复数设为1 000。得到进化树,保存为Newick格式。将Newick格式的文件输入到EvolView网站(https://www.evolgenius.info)进行美化。根据进化关系对烟草PsaA/PsaB基因家族成员进行分类和重命名。

1.2.4 保守基质和基因结构分析

将筛选后的烟草PsaA/PsaB基因家族的蛋白序列文件上传至 MEME网站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme),设置Motif数量为20,其余参数保持不变。下载Motif 图和结果文件中的 Mast.xml 文件。利用TBtools的Visualize MEME/MAST motif Pattern功能将下载的 Mast 文件可视化,得到结构域分析结果,利用PhotoshopCS6将系统进化树与结构域一一对应。下载烟草K326的GFF文件,打开TBtools的Visualize Gene Structure(from GTF/GFF3 File),上传GFF文件和基因名文件,得到基因结构分析结果。

1.2.5 启动子顺式作用元件预测

根据已下载的烟草K326的注释文件GFF和基因组文件,利用TBtools软件的 GXF Sequence Extract 提取烟草PsaA/PsaB基因上游2 000 bp序列作为启动子;再利用TBtools软件的Fasta Stats检测提取启动子区域的正确性,将启动子序列上传至植物启动子在线分析网站PlantCARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)。从tab文件中筛选目标调控元件,提取对应的基因名、起止位点和Domain,利用TBtools的HeatMap将基因家族启动子顺式元件进行可视化,利用Simple BioSequence Viewer 将启动子预测元件结构可视化。

1.2.6 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(jasmonic acid methyl ester,MeJA)和低温胁迫处理

将烟草K326植株放置在25 ℃光照培养箱中,用霍格兰营养液进行水培。16 h光照/8 h 黑暗,湿度70%,待烟草植株长到四片叶时,选取长势一致且生长良好的植株,设置处理组和对照组进行实验。
分别对烟草幼苗进行20% PEG6000、ABA(100 μmol/L)、MeJA(100 μmol/L)和低温(4 ℃)胁迫处理。PEG处理:用霍格兰营养液配制20% PEG6000,对烟草幼苗进行水培,对照组用霍格兰营养液进行水培。ABA、MeJA处理:分别给叶片喷洒100 μmol/L的ABA和100 μmol/L的MeJA,对照组给叶片喷洒相同体积的去离子水。低温处理:将烟草植株置于4 ℃光照培养箱中,对照组置于25 ℃光照培养箱中。处理7 h时,取第二叶位叶片,处理组和对照组均设置3次生物学重复,放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.7 栽培烟草接种TMV和PVY

将烟草K326植株种植于温室条件下,确保烟草植株处于无菌、无毒环境中,待烟草植株长到四片叶时,把植株分为处理组和对照组。以保存的携带TMV和PVYN的烟草叶片为毒源,在含有石英砂和磷酸缓冲液的研钵中研磨,经纱布过滤后,用摩擦的方式把毒液接种在烟苗的第二片和第三片真叶上,接种过的烟草单独隔离种植,以免被其他因素影响。对照组使用磷酸缓冲液,用同样的方式进行模拟接种,15 d后取接种叶上一叶位的叶片保存备用。

1.2.8 RNA提取和RT-qPCR分析

根据全式金植物RNA纯化试剂盒(ER301-01)的实验步骤,提取实验组和对照组植株叶肉和叶脉的RNA。根据全式金反转录试剂盒(AT311-01)的实验步骤合成第一链cDNA,同时去除RNA模板中残留的基因组DNA,进行PCR扩增,利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。根据表1中候选基因RT-qPCR引物,用荧光定量PCR试剂盒(TG-AQ601-02)进行 RT-qPCR 扩增,以Actin作为内参基因,将反转录所得cDNA稀释5倍后,用SYBR Green PCR 反应体系在荧光定量 PCR 仪中扩增。RT-qPCR反应条件:94 ℃,30 s;94 ℃,5 s,58 ℃,15 s,共40个循环;72 ℃,40 s。RT-qPCR 反应体系:cDNA 1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×perfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL,Passive Reference Dye(50×,optional) 0.4 μL,Nuclease-free Water补充至 20 μL。用2-ΔΔCt 公式计算表达量。
表1 烟草PsaA/PsaB基因家族定量引物

Tab.1 Quantitative primers of PsaA/PsaB gene family in tobacco

基因名称 上游引物 (5'-3') 下游引物 (5'-3')
Nta_PsaA/PsaB_1 CCAGACCGGGTCATTTCTCA TTGGATCACTTAGCCACGCT
Nta_PsaA/PsaB_2 CGCCGAGTATTGAGGAGGAC CGCTCGGCCAAAGAAAGATG
Nta_PsaA/PsaB_3 TAAATGGTGACGTAGGCGGG AATACCCCAGTTGGTCGCTG
Nta_PsaA/PsaB_4 TGTTTGCCGGAACCAGAAGT CCCGCCTACGTCACCATTTA
Nta_PsaA/PsaB_5 GCAGGCGAGACTAAGCAGAA AGTCCTAGTAGCCCTGCCAA
Nta_PsaA/PsaB_6 GGGGGTTTCCGAGCAATACA GTACTTGATGCCCCACCCAA
Nta_PsaA/PsaB_8 TATCCCAGTTTTGCCGAGGG GCATGCCATGACGTCGTTAG
Nta_PsaA/PsaB_9 TTCTGGAAAGGGAACGCGAA CAATCCAAGGCACCATCCCT
Nta_PsaA/PsaB_10 TCCAATCGGGCTACCTCTGA TACTTGATGCCCAGCCCAAG
Nta_PsaA/PsaB_11 TTCTGGAAAGGGAACGCGAA CGGTCTACACACACATGGCT
Nta_PsaA/PsaB_13 CCATGGTCAGCTTGAGGGAG CCTTGTCCCACCAGATCCAC
Nta_PsaA/PsaB_14 CCATGGTCAGCTTGAGGGAG CCTTGTCCCACCAGATCCAC
Nta_PsaA/PsaB_15 TCCCCAAAAAGTGGATCCCG AACCCATGGTTATGGACCCG
Nta_PsaA/PsaB_16 TTTTTCGTGCAATGGCCCAG CATCCATGCCCAAGCCGATA
Nta_PsaA/PsaB_17 TCTTCAACGAGTGGTCCAGC ATGTCACAAGTACCGCCTCG
Nta_PsaA/PsaB_18 GACGAGGCGGTACTTGTGAT ACATCCATGCCCAAACCGAT
Nta_PsaA/PsaB_19 ACCCATGCTTTAGCACCTGG ACGGGAACTGCGAGCAAATA
Nta_PsaA/PsaB_20 TCGGTTTGGGCATGGATGTT GGCCAAAGGTGTGTGTTCAT
Nta_PsaA/PsaB_21 CAAGGCTTAGCTCAGGACCC GCCGGTTGACCAAAATGAGG
Nta_PsaA/PsaB_22 CTCCGAGAGCCTTGAGCATT CGACGAGTAGTGGGGTCTTG
Nta_PsaA/PsaB_23 ACAGCGGTTGGATGGTTAGG CCGTTGAGTTCACCGTCGTA
Nta_PsaA/PsaB_24 GGGATGTTTGGGGCAGTGTA TGCCCATAAGAAATCGCGGA
Nta_PsaA/PsaB_25 TTAATGGGTGGCTCCGCAAT GGCTCTCGGCTGAATAGCAT
Nta_PsaA/PsaB_26 ACAGGAGCTTTTGCTCATGGA AATCCCAGAAAGAGGCTGGC
Nta_PsaA/PsaB_27 ACAGGAGCTTTTGCTCATGGA AATCCCAGAAAGAGGCTGGC
Actin CCTGAGGTCCTTTTCCAACCA GGATTCCGGCAGCTTCCATT

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

由表2可知,在烟草K326中共得到27个烟草PsaA/PsaB基因家族序列。利用ExPASy在线网站对烟草PsaA/PsaB基因家族成员进行理化性质分析,结果显示,烟草PsaA/PsaB基因家族成员的氨基酸数目介于85~684,相对分子质量介于9 464.57~79 171.19,等电点介于4.86~10,不稳定系数介于15.58~46.35,氨基酸序列的平均亲水系数(grand average of hydropathicity,GRAVY)介于-0.354~0.35。通过NCBI数据库和叶绿体基因组数据库(CGTR)检索发现27个烟草PsaA/PsaB基因中,定位于细胞质和细胞质膜的19个基因来源于叶绿体基因组,定位于线粒体的6个基因来源于线粒体基因组,定位于细胞核的2个基因来源于核基因组。通过TBtools软件,发现有9个烟草PsaA/PsaB基因定位于染色体上。
表2 烟草PsaA/PsaB基因理化性质分析

Tab.2 Analysis of physicochemical properties of Nta_PsaA/PsaB genes

基因ID 基因名称 氨基酸数目 相对分子质量 等电点 不稳定系数 平均亲水系数 基因组来源 染色体定位
Nitab4.5_0003175g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_1 85 9 827.04 5.75 31.15 -0.193 叶绿体基因组 Scf_0003175
Nitab4.5_0003101g0120.1 Nta_PsaA/PsaB_2 158 18 343.76 5.47 44.31 -0.361 叶绿体基因组 Scf_0003101
Nitab4.5_0008665g0020.1 Nta_PsaA/PsaB_3 363 41 404.48 8.71 21.28 -0.016 线粒体基因组 Scf_0008665
Nitab4.5_0004822g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_4 281 31 826.11 5.07 39.19 -0.096 叶绿体基因组 Scf_0004822
Nitab4.5_0010951g0020.1 Nta_PsaA/PsaB_5 209 22 742.7 9.97 27.01 0.017 线粒体基因组 Scf_0010951
Nitab4.5_0001152g0890.1 Nta_PsaA/PsaB_6 151 17 011.82 10 32.87 0.079 叶绿体基因组 Chr_19
Nitab4.5_0001783g0050.1 Nta_PsaA/PsaB_7 170 20 055.33 6.65 33.85 0.01 叶绿体基因组 Chr_07
Nitab4.5_0023521g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_8 411 47 728.22 5.98 42.59 -0.354 叶绿体基因组 Scf_0023521
Nitab4.5_0004100g0040.1 Nta_PsaA/PsaB_9 245 27 739.03 9.84 32.76 -0.282 线粒体基因组 Scf_0004100
Nitab4.5_0001127g0240.1 Nta_PsaA/PsaB_10 245 27 367.9 9.9 32.16 -0.118 线粒体基因组 Chr_19
Nitab4.5_0000172g0970.1 Nta_PsaA/PsaB_11 392 43 465.54 9.89 38.54 -0.018 线粒体基因组 Chr_19
Nitab4.5_0002607g0030.1 Nta_PsaA/PsaB_12 124 13 754.87 5.90 31.31 0.177 叶绿体基因组 Scf_0002607
Nitab4.5_0000143g0310.1 Nta_PsaA/PsaB_13 544 60 019.23 4.86 46.35 -1.079 核基因组 Chr_11
Nitab4.5_0001198g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_14 544 59 939 4.86 45.41 -1.092 核基因组 Chr_13
Nitab4.5_0001946g0030.1 Nta_PsaA/PsaB_15 684 79 171.19 5.60 42.57 -0.318 叶绿体基因组 Scf_0001946
Nitab4.5_0002446g0050.1 Nta_PsaA/PsaB_16 190 21 196.29 6.64 15.58 0.175 叶绿体基因组 Scf_0023295
Nitab4.5_0023295g0020.1 Nta_PsaA/PsaB_17 256 29 507.11 6.65 35.6 0.134 叶绿体基因组 Scf_0023295
Nitab4.5_0017205g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_18 134 15 703.24 6.38 25.9 0.275 叶绿体基因组 Scf_0017205
Nitab4.5_0023521g0020.1 Nta_PsaA/PsaB_19 314 34 914.35 7.86 30.54 0.35 叶绿体基因组 Scf_0023521
Nitab4.5_0002607g0040.1 Nta_PsaA/PsaB_20 114 13 443.69 6.15 25.31 0.347 叶绿体基因组 Scf_0002607
Nitab4.5_0000718g0190.1 Nta_PsaA/PsaB_21 85 9 464.57 6 45.16 -0.252 叶绿体基因组 Chr_19
Nitab4.5_0000747g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_22 333 37 948.05 6.7 39.86 0.329 叶绿体基因组 Chr_09
Nitab4.5_0011099g0030.1 Nta_PsaA/PsaB_23 398 44 578.21 6.22 31.79 0.119 叶绿体基因组 Scf_0023295
Nitab4.5_0002005g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_24 316 35 522.1 6.33 34.19 -0.003 叶绿体基因组 Chr_17
Nitab4.5_0002446g0030.1 Nta_PsaA/PsaB_25 578 64 916.63 6.62 29.61 0.233 线粒体基因组 Scf_0002446
Nitab4.5_0006478g0040.1 Nta_PsaA/PsaB_26 196 21 875.16 6.14 23.5 0.318 叶绿体基因组 Scf_0006478
Nitab4.5_0023295g0010.1 Nta_PsaA/PsaB_27 248 27 879.22 6.39 27.33 0.281 叶绿体基因组 Scf_0023295

2.2 系统进化树

以拟南芥PsaA(ATCG00350.1)和PsaB(ATCG00340.1)作为种子序列,通过BLAST比对,发现拟南芥中PsaA和PsaB没有其余的同源蛋白。为研究烟草PsaA/PsaB基因家族及其与拟南芥的进化关系,利用MEGA11软件对鉴定到的27个烟草PsaA/PsaB蛋白序列和拟南芥PsaA、PsaB进行系统进化树构建。根据系统进化树,可将27个烟草PsaA/PsaB基因家族成员分为3个(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)亚家族。Ⅰ类亚家族包含11个成员,与拟南芥PsaA蛋白同源性较高,分别为Nta_PsaA/PsaB_1 ~ 11;Ⅱ类亚家族包含3个成员,与拟南芥的同源性介于PsaA和PsaB之间,分别为Nta_PsaA/PsaB_12~14;Ⅲ类亚家族包含13个成员,与拟南芥PsaB蛋白同源性较高,分别为Nta_PsaA/PsaB_15~27(图1)。上述结果可以看出,烟草中PsaA和PsaB类基因较拟南芥中出现大量扩增。
图1 烟草PsaA/PsaB基因家族系统发育进化树

注:网络版为彩图。

Fig.1 Phylogenetic tree of Nta_PsaA/PsaB gene family

2.3 保守结构域和基因结构分析

为研究烟草PsaA/PsaB基因家族的保守结构域特征,通过MEME在线网站进行保守结构域分析,结果显示,Ⅰ类亚家族中大多数序列包括Motif 6、7、20,其中特有序列是Motif 20;Ⅱ类亚家族中大多数序列包括Motif 15、16、19,其中特有序列是Motif 16、19;Ⅲ类亚家族中大多数序列包括Motif 2、5、9,其中特有序列是Motif 17,相对于其他2个亚家族,Ⅲ类亚家族的Motif数量最多(图2)。
图2 烟草PsaA/PsaB基因保守结构域模式图

注:网络版为彩图。

Fig.2 Conserved domain pattern of Nta_PsaA/PsaB genes

利用TBtools绘制烟草PsaA/PsaB基因家族结构, 结果显示烟草PsaA/PsaB基因家族的内含子和外显子长度和数量存在差异。Ⅰ类亚家族外显子数目普遍较多,为2~10个,其中最多的Nta_PsaA/PsaB_11含有10个外显子;Ⅱ类亚家族外显子数目为3~10个,其中最多的Nta_PsaA/PsaB_13~14含有10个外显子;Ⅲ类亚家族外显子数目为1~6个,其中最多的Nta_PsaA/PsaB_22、24、25含有6个外显子(图3)。Nta_PsaA/PsaB_1、18、24在5'区域含有UTR,Nta_PsaA/PsaB_13~14在3'区域含有UTR。
图3 烟草PsaA/PsaB基因家族结构

注:网络版为彩图。

Fig.3 Nta_PsaA/PsaB gene family structure

总体来看,同一进化树分支上基因结构域的组成及位置相似,且距离越近的基因相似度越高,如Nta_PsaA/PsaB_1~4,从而验证了Nta_PsaA/PsaB基因家族类群分类的可靠性。但同一亚类Nta_PsaA/PsaB基因家族结构域数量和类型仍存在差异,基因结构也各不相同,保守结构域的功能还需要进一步探究和发现。

2.4 启动子顺式作用元件分析

为了解烟草 PsaA/PsaB基因家族可能的生物学功能,通过在线软件PlantCARE分析烟草PsaA/PsaB基因上游2 000 bp启动子序列区域,得到烟草PsaA/PsaB基因家族的启动子顺式作用元件预测结果(图4、5)。
图4 烟草PsaA/PsaB基因家族启动子顺式作用元件统计

注:网络版为彩图。

Fig.4 Cis-element statistics in the promoters of Nta_PsaA/PsaB gene family

图5 烟草PsaA/PsaB基因家族启动子顺式作用元件分析

注:网络版为彩图。

Fig.5 Cis-element analysis in the promoters of Nta_PsaA/PsaB gene family

烟草PsaA/PsaB基因启动子均含有光响应元件,大多含有激素应答和响应逆境胁迫的顺式作用元件,如水杨酸(salicylic acid,SA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、生长素(auxin,IAA)等激素响应元件。同时,烟草PsaA/PsaB基因启动子区域还发现了干旱响应元件、低温响应元件、参与干旱诱导的MYB结合位点、防御和应激反应的顺式作用元件、伤口响应元件、参与光响应性诱导的MYB结合位点、厌氧诱导元件等。
Nta_PsaA/PsaB_1、2等7个基因含有水杨酸响应元件,Nta_PsaA/PsaB_2、4等16个基因含有脱落酸响应元件,Nta_PsaA/PsaB_3、4等12个基因含有茉莉酸响应元件,说明这些基因可能与调控植物逆境胁迫有关。Nta_PsaA/PsaB_11、23等9个基因含有参与干旱诱导的 MYB 结合位点,推测与抗旱胁迫有关;Nta_PsaA/PsaB_16、17等15个基因含有低温调控响应元件,可能与植物在低温环境下的生理反应有关;Nta_PsaA/PsaB_14、16等10个基因含有防御和应激响应元件,可能参与烟草生长发育调控及多种逆境胁迫调控。综上,烟草PsaA/PsaB基因家族可能与烟草的生长发育、逆境响应、胁迫调控等多种生理过程密切相关。

2.5 烟草PsaA/PsaB基因家族逆境胁迫表达分析

为探究烟草PsaA/PsaB基因家族对逆境胁迫的响应机制,在干旱(PEG和ABA)、MeJA、低温胁迫和感染PVY、TMV的条件下通过RT-qPCR对PsaA/PsaB基因家族成员进行基因表达分析。

2.5.1 烟草PsaA/PsaB基因响应干旱的表达分析

PEG6000是对水分具有强烈亲和性的非渗透调节剂,ABA途径是调节植物干旱响应的重要策略,二者被广泛用于干旱胁迫研究。根据启动子顺式作用元件预测结果,挑选具有干旱和ABA响应元件的13个Nta_PsaA/PsaB基因(Nta_PsaA/PsaB_1、2、4、6、8、9、13、14、15、18、21、26、27),分别用20% PEG6000和100 μmol/L ABA处理烟草幼苗,7 h后对PEG和ABA处理的烟草叶片进行RT-qPCR分析。
结果显示,PEG处理后,8个烟草PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_2、9极显著下调;5个烟草PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_13、14极显著上调(图6)。ABA处理后,5个烟草PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_27极显著下调;8个烟草PsaA/PsaB基因表达上调,但未达到统计学显著水平(图7)。
图6 烟草PsaA/PsaB基因PEG胁迫7 h后的RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.6 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes at 7 h after PEG stress

图7 烟草PsaA/PsaB基因在ABA胁迫7 h后的RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.7 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes at 7 h after ABA stress

2.5.2 烟草PsaA/PsaB基因响应MeJA的表达分析

根据启动子顺式作用元件预测结果,挑选具有MeJA响应元件的9个烟草PsaA/PsaB基因(Nta_PsaA/PsaB_1、4、10、11、14、15、21、26、27)进行研究。用100 μmol/L MeJA处理烟草幼苗,7 h后对MeJA处理的烟草叶片进行RT-qPCR分析。结果表明,MeJA处理后,7个烟草PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_10、11、14、15、21极显著下调;2个烟草PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_27极显著上调(图8)。
图8 烟草PsaA/PsaB基因在MeJA胁迫7 h后的RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.8 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes at 7 h after MeJA stress

2.5.3 烟草PsaA/PsaB基因响应低温的表达分析

根据启动子顺式作用元件预测结果,挑选具有2个以上低温响应元件的9个烟草PsaA/PsaB基因(Nta_PsaA/PsaB_1、2、6、8、16、17、23、26、27)进行研究。在4 ℃低温处理烟草幼苗7 h后对烟草叶片进行RT-qPCR分析,结果表明,低温处理后,8个烟草PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_1、6、8、16、17、26、27极显著上调,Nta_PsaA/PsaB_23极显著下调(图9)。
图9 烟草PsaA/PsaB基因在低温胁迫7 h后的RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.9 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes at 7 h after cold stress

2.5.4 烟草PsaA/PsaB基因响应TMV的表达分析

根据启动子顺式作用元件预测结果,挑选具有MeJA和水杨酸响应元件的12个烟草PsaA/PsaB基因(Nta_PsaA/PsaB_1、3、4、5、10、11、14、15、21、23、26、27)进行研究。烟草幼苗接种TMV病毒15 d后对TMV侵染的烟草叶片进行RT-qPCR分析。结果表明,感染TMV后,9个烟草PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_1、4、5、11、23极显著下调;3个烟草PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_3、15显著上调(图10)。
图10 TMV 感染后烟草叶肉PsaA/PsaB基因RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.10 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes in tobacco mesophyll after TMV infection

2.5.5 烟草PsaA/PsaB基因响应PVY的表达分析

选取25个烟草PsaA/PsaB基因进行PVY应答分析。烟草幼苗接种PVY病毒15 d后,分别取PVY侵染的烟草叶肉和叶脉组织,对烟草PsaA/PsaB基因家族成员进行RT-qPCR分析。PVY感染后,烟草叶肉组织中有6个PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_3极显著上调;19个PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_2、5、9、23、25极显著下调(图11)。叶脉组织中有8个PsaA/PsaB基因表达上调,其中Nta_PsaA/PsaB_5、9、11、13、14极显著上调;17个PsaA/PsaB基因表达下调,其中Nta_PsaA/PsaB_3、6、16、17、18、20、22、23、26极显著下调(图12)。
图11 PVY感染后烟草叶肉中PsaA/PsaB基因RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.11 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes in tobacco mesophyll after PVY infection

图12 PVY感染后烟草叶脉中PsaA/PsaB基因RT-qPCR结果

注:*与* *分别表示在P<0.05与P<0.01水平上差异显著。

Fig.12 RT-qPCR results of Nta_PsaA/PsaB genes in tobacco vein after PVY infection

3 讨论

3.1 烟草PsaA/PsaB基因家族鉴定

PsaA和PsaB是存在于植物叶绿体类囊体膜上的膜蛋白,以异源二聚体的形式组合成PSⅠ的核心蛋白复合物,直接影响整个PSⅠ复合物的组装,在叶绿体光反应过程中发挥重要功能[9]。大量研究表明,植物遭受逆境胁迫后常引起PSⅠ结构和功能损伤,导致PSⅠ核心蛋白复合物PsaA和PsaB的积累发生改变[14-15]。目前,大多数植物中PsaA和PsaB同源基因数量较少,尚未有相关基因家族的研究报道。
本课题组通过全基因组鉴定,发现拟南芥中仅有1个PsaA基因和1个PsaB基因,水稻中有8个PsaA/PsaB同源基因,烟草中有27个PsaA/PsaB同源基因。可以看出,烟草中PsaA/PsaB基因家族数量明显扩张,这可能是由于相比于其他物种,烟草叶片大,叶面积明显增加,在物种进化过程中,烟草为了提供生长发育所需的能量,需要更多的光合效能,从而导致参与叶绿体光反应的重要核心蛋白复合物PsaA和PsaB数量大量扩张。拟南芥中PsaA和PsaB基因来源于叶绿体基因组[26],烟草27个PsaA/PsaB基因中有19个来源于叶绿体基因组、2个来源于核基因组、6个来源于线粒体基因组,说明烟草中大多数PsaA/PsaB基因是叶绿体基因,少量是细胞核和线粒体基因。研究表明,植物胁迫可以降低核基因和光合作用相关质体基因的表达,干扰叶绿体发育[26],预测烟草中存在于核基因组和质体基因组的PsaA/PsaB类基因在叶绿体发育及与之相关的胁迫应答中发挥非常重要的调控功能。
本文根据系统进化关系,将烟草27个PsaA/PsaB基因分为3个亚类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其中Ⅰ类包含11个成员,与拟南芥PsaA蛋白同源性较高;Ⅲ类包含13个成员,与拟南芥PsaB蛋白同源性较高;Ⅱ类包含3个成员,同源性介于拟南芥PsaA和PsaB之间,Ⅱ类的3个成员中Nta_PsaA/PsaB_13和Nta_PsaA/PsaB_14来源于核基因组,它们与PsaA亚支和PsaB亚支分离,单独成为一个分支(图1)。这可能是导致烟草Nta_PsaA/PsaB_13和Nta_PsaA/PsaB_14在系统进化上与叶绿体基因组和线粒体基因组来源的PsaA/PsaB基因分化的原因。不同亚类中特有的Motif可能是导致基因功能分化的重要原因。目前,尚未有烟草PsaA/PsaB基因家族Motif功能的研究报道,该结果为进一步开展各个亚家族Motif的功能研究奠定了基础。
多基因家族进化过程中,基因结构差异在功能多样性中起重要作用[32]。基因结构分析发现,烟草PsaA/PsaB基因结构域的内含子和外显子数目和长度差异较大,相比而言,Ⅰ类亚家族内含子较短,数量较多,Ⅲ类亚家族内含子较长,数量较少(图3)。大多数基因没有5'UTR和3'UTR,这可能是由于烟草基因组有一部分是Scoffold,UTR区的注释信息不完整,从而影响基因结构的准确预测,要想获得准确完整的基因结构信息,需要进一步获得高质量的染色体水平或T2T水平的参考基因组。

3.2 烟草PsaA/PsaB基因家族参与抗逆和抗病的响应

光合作用的光反应在类囊体膜上进行,PsaA和PsaB蛋白在PSⅠ类囊体膜上的功能已有深入研究[33-34],但在植物逆境胁迫中的功能研究较少。有研究表明,PsaA和PsaB基因在植物逆境胁迫中,存在不同程度的响应,例如:变绿异燕麦在低温胁迫后叶绿素含量下降,PsaA和PsaB基因表达水平明显上调[27];干旱胁迫后,耐旱水稻品种中PsaA等基因上调,提高了植株的抗旱能力[29];在低温条件下,PsaA的RNA编辑效率显著下降,进一步影响植物的光合作用能力[30]。本研究发现,烟草PsaA/PsaB基因的启动子中包含大量光、干旱、低温等逆境胁迫的响应元件,同时还存在许多水杨酸、脱落酸、茉莉酸等与抗病、抗逆相关的激素响应元件(图4、5)。光合作用与植物生长发育及逆境胁迫应答息息相关,烟草PsaA/PsaB基因启动子中包含的逆境和激素响应元件预示PsaA/PsaB基因可能参与烟草的生物和非生物胁迫应答。为进一步明确烟草PsaA/PsaB基因参与的生物学功能,根据启动子调控元件预测结果,筛选部分基因进行MeJA、ABA、干旱和低温胁迫处理,经RT-qPCR检测发现,MeJA处理后,烟草叶片中5个PsaA/PsaB基因表达极显著下调(图8),MeJA在植物生长发育和多种逆境胁迫(抗病、抗虫、温度、干旱、盐和重金属等)调控中起重要作用[35],说明烟草PsaA/PsaB基因参与MeJA介导的生长发育或逆境响应调控。PEG处理后,烟草叶片中4个PsaA/PsaB基因表达显著下调,其中2个极显著下调,2个显著上调(图6)。ABA处理后,烟草叶片中3个PsaA/PsaB基因表达显著下调(图7)。PEG和ABA常用于模拟植物干旱和研究干旱响应,ABA途径是调节植物干旱响应的重要策略,干旱胁迫会激发植物器官产生和积累ABA并激活下游信号传导[36]。本研究中,烟草在PEG模拟干旱胁迫后,部分PsaA/PsaB基因显著变化,但对应的ABA响应并不明显,说明烟草PsaA/PsaB类基因参与干旱响应,但并非直接与ABA调控的干旱响应途径相关。4 ℃低温处理后,烟草叶片中7个PsaA/PsaB基因表达极显著上调,其中4个上调10倍以上,说明烟草PsaA/PsaB基因受低温胁迫诱导表达,且对低温具有较强响应。
研究发现PSⅠ中的蛋白复合体参与植物抗病毒反应,如Jiménez 等[13]发现PSⅠ中PsaK蛋白与病毒CI蛋白互作,PsaK基因的下调导致更高的PPV积累。有关PSⅠ中PsaA和PsaB基因在植物病毒调控中的研究较少,Das等[28]发现烟草植株被TMV感染后,PsaA和PsbB蛋白的丰度显著降低,但未对其进行深入的功能解析。课题组前期通过转录组测序发现,PVY感染烟草后 PSⅠ相关的基因大量下调[31],PsaA和PsaB作为PSⅠ的核心蛋白,目前植物中尚未有相关基因家族及其受病毒调控的研究报道。本研究利用RT-qPCR分析烟草PsaA/PsaB基因在PVY和TMV感染后的表达模式,挑选启动子中含有MeJA和水杨酸响应元件的12个烟草PsaA/PsaB基因,在TMV感染后进行RT-qPCR检测,结果显示,TMV感染后,烟草叶片中7个基因显著下调,其中5个极显著下调,2个显著上调(图10)。接种脉坏死性型PVY(PVYN)后,烟草主要表现出脉坏死症状,为了解PVY病症发生过程中PsaA/PsaB基因是否发生变化,分别对PVY感染后的叶肉组织和叶脉组织进行研究,对27个PsaA/PsaB基因进行RT-qPCR检测,其中Nta_PsaA/PsaB_7和Nta_PsaA/PsaB_12表达量较多,无法检测。其余25个基因检测结果显示,PVY感染后,烟草叶肉组织中有2个基因显著上调,其中1个极显著上调,有12个基因显著下调,其中5个极显著下调;叶脉组织中有7个基因显著上调,其中5个极显著上调,有16个基因显著下调,其中9个极显著下调;有10个基因在叶肉和叶脉中均显著下调(图11、12)。由此可见,PVY感染后,大多数烟草PsaA/PsaB基因表达受抑制,在叶脉组织中抑制更明显。
上述结果表明,烟草在感染TMV和PVY后,大多数PsaA/PsaB基因表达受到抑制,PVY感染后基因抑制程度更明显,且在病症组织叶脉中抑制程度最明显。这说明植物在病毒感染后,光合作用受到影响,PSⅠ中的核心蛋白PsaA和PsaB功能受到抑制,这可能与病状出现后植物叶绿体功能损伤相关。

4 结论

本研究在栽培烟草K326中共鉴定到 27个PsaA/PsaB基因家族成员,将其分为 3 个亚家族,其家族基因含有多种胁迫和激素响应元件。RT-qPCR 分析发现,烟草PsaA/PsaB基因家族在低温胁迫后诱导表达,在MeJA、PEG、TMV和PVY胁迫后表达受到抑制,说明PsaA/PsaB基因参与烟草非生物胁迫的应答过程,研究结果为进一步探究PsaA/PsaB基因家族在调控植物逆境胁迫中的作用提供了参考。

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