牛肉作为瘦红肉,具有蛋白质利用率高,脂肪含量低,维生素以及铁、钙、铜、锌、锰等常量、微量元素丰富等特点,被认为是良好的营养膳食来源,也是全球销量最高的肉类之一[1]。以牛肉糜为原料的牛肉制品食用方便,深受消费者喜爱。当前,各种以凝胶为基础的预制牛肉制品在市场上逐渐增多,如牛肉丸、重组牛排、咸味牛肉饼、预制肉饼等[2],可见,牛肉糜是常规牛肉制品加工以及新型牛肉制品研发的重要原料形式。
腌制是牛肉糜制品加工过程中的重要环节,由于牛肉糜的比表面积较牛肉块成倍增加,所以牛肉糜在腌制过程中极易发生腐败变质[3]。香辛料能提升肉制品品质,改善肉制品的色泽和风味,其浓郁的香气是牛肉制品形成良好风味的关键。肉制品加工过程中常用的香辛料有八角、茴香、胡椒、肉桂、辣椒、生姜、花椒等,其中,八角茴香中的茴香脑、丁香中的丁香酚以及肉桂中的肉桂醛等香气物质均对牛肉制品的风味具有明显改善作用[4]。此外,香辛料中所含的酚类、萜类和醛类等成分是抗菌的关键因子,在肉制品腌制过程中能够发挥抑菌功能[5]。Xu等[6]研究发现丁香提取物对风干鸭的5种腐败菌有显著抑制作用;黑胡椒对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等具有抑制作用[7]。反式茴香脑是八角茴香中的主要抑菌成分[8],而部分萜类化合物(如α-蒎烯、月桂烯、水芹烯、芳樟醇等)对反式茴香脑的抑菌效果会产生协同作用[9],它们协同降解细菌细胞壁,破坏细菌的细胞质膜或使膜蛋白变性,致使细菌细胞内营养物质流失,细菌死亡[10]。小茴香精油的化学成分主要是反式茴香脑和柠檬烯,Elbaz等[11]研究发现小茴香叶精油对2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌)和3种革兰氏阴性菌 (铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌)均具有抑制作用。Milagres等[12]研究指出,肉桂精油对李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌具有显著抑制作用。肉桂的抑菌成分是精油,报道指出肉桂精油中的主要抑菌物质为肉桂醛[13]。姜科的许多物种含有多糖、多酚、萜类、姜辣素等活性成分[14],Kumar等[15]的研究表明,生姜中的酚类化合物,如 6-姜酚、6-姜烯酚和姜油酮等,对紫色杆菌和铜绿假单胞菌均表现出较好的群体感应抑制活性。
通常,肉制品腌制过程中会使用多种复合香辛料。复合香辛料一般由5种或13种单一香辛料组成,不同种类的复合香辛料对牛肉腌制品品质的影响差异研究尚未见报道。本研究选取当前市场上使用广泛的2种复合香辛料五香粉和十三香粉腌制牛肉糜,通过测定牛肉糜在腌制过程中的理化特性和微生物指标,探究不同种类的复合香辛料对牛肉糜品质指标和微生物指标的作用效果,旨在为市场复合香辛料的选择提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
牛肉购自陕西秦牧汇食品有限责任公司。五香粉(成分包括:花椒、八角、小茴香、桂皮和丁香),十三香粉(成分包括:八角、肉桂、小茴香、花椒、高良姜、肉豆蔻、干姜、黑胡椒、砂仁、丁香、草果、白芷、山楂和橘皮),食盐;购自西安振龙调味副食有限公司。
1.2 样品制备
将牛肉表面的筋膜和脂肪去除后绞碎。对照组使用2%的食盐腌制;处理1组使用2.5%的五香粉与1%的食盐腌制;处理2组使用2.5%的十三香粉与1%的食盐腌制。腌制过程在4 ℃冰箱中进行,分别于腌制0、12、24、36、48、60和72 h时测定各组样品的相应指标。每组样品设置3个重复。
1.3 TVB-N含量测定
采用微量扩散法[16]对腌制牛肉糜样品的TVB-N含量进行测定。
1.4 菌落总数测定
参照《GB 4789.2—2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》对腌制牛肉糜样品进行菌落总数测定[17]。
1.5 电子鼻测定
采用SuperNose-18感应电子鼻分析系统(Isenso公司,美国)参照Xiao等[18]的方法对样品进行电子鼻测定。
1.6 16S rRNA高通量测序
1.6.1 样品处理和DNA提取
腌制牛肉糜于72 h后取样,每个样品12.5 g,放入无菌均质袋中,加入25 mL的无菌生理盐水(8.5 g/L)均质10 min,使用无菌纱布过滤。滤液在1 000 r/min条件下离心10 min后,将上清液于10 000 r/min条件下继续离心10 min,弃上清液,取沉淀。-80 ℃冰箱保存备用。
采用君诺德DNA提取试剂盒(离心柱型2512)提取样品DNA。通过ND-1000纳米滴定分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)检测DNA的浓度和纯度。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量。
1.6.2 PCR扩增和Miseq测序
使用细菌16S rRNA V3~V4可变区引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对牛肉糜样本中细菌的16S rRNA V3~V4可变区进行扩增。PCR扩增体系共25 μL,包括2×Tap PCR StarMix with Loading Dye 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各1 μL,gDNA 模板1 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,循环30次;72 ℃延伸5 min。
使用2%琼脂糖凝胶电泳提取扩增产物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行纯化,最后用QuantiFluor-ST(Promega, USA)进行定量。样品送至上海派森诺生物科技股份有限公司Illumine MiSeq平台进行测序。
1.6.3 数据处理
使用QIIME2(2019.4)的DADA2方法进行序列质控,对获得的高质量有效序列进行相当于100%相似度的聚类,获得的每个去重序列称为ASVs。采用QIIME2基于细菌Greengenes数据库进行物种分类学注释,按最低样本序列量的95%进行抽平,并基于分类学信息在门和属分类水平上进行群落结构统计。
采用QIIME2和R语言进行α-多样性分析、β-多样性分析和物种组成差异分析。
1.7 数据统计与分析
所有指标平行测定3次,结果以平均值±标准差进行表示。采用SPSS Statistics 27对数据进行差异显著性分析,P<0.05认为差异显著。
2 结果与分析
2.1 TVB-N含量变化
2.2 菌落总数变化
在牛肉糜冷藏腌制期间,各处理组的菌落总数均呈上升趋势,但处理1组和处理2组的菌落总数显著低于对照组(P<0.05,图2)。牛肉糜在冷藏腌制72 h后,处理1组和处理2组的菌落总数对数值分别为4.06和3.91,而对照组已达到5.12;对照组、处理1组和处理2组样品的菌落总数分别增加了58.02%、25.70%和23.34%。
2.3 风味分析
基于电子鼻的PCA结果可以看出(图3a),PC1(97.5%)和PC2(1.0%)的累积方差贡献率为98.50%,表明PCA结果能够反映牛肉糜气味的整体信息。PC1的贡献率远大于PC2,表明各组样品在横坐标上的间距越大,其差异性也就越大。处理1组和处理2组样品的间距较小,但二者与对照组的间距均较大,可见添加香辛料对牛肉糜的气味有明显影响。
由雷达图可以看出(图3b),各组牛肉糜样品的气味类型接近但强度存在一定差异。传感器S4(硫化物)、S7(短链烷烃类)、S10(含氢气体)能清晰地显示出香辛料对牛肉糜气味的影响,其中以S7传感器的响应强度最高。在S3(臭氧)和S9(芳香化合物、烷烃类)传感器处,各组牛肉糜产生的信号均较弱。总体而言,添加五香粉和十三香粉的牛肉糜样品与对照组在多数传感器处的气味存在差异。
2.4 16S rRNA高通量测序分析
2.4.1 α-多样性和β-多样性分析
2.4.2 腌制牛肉糜微生物区系的组成
在门水平,不同处理组的优势菌门相同,均为变形菌门、厚壁菌门和放线菌门(图6a),但各处理组间的优势菌门相对丰度存在差异。对照组、处理1组和处理2组样品中变形菌门占比分别为47.45%、47.32%和43.26%,厚壁菌门占比分别为43.23%、44.21%和46.00%。十三香粉可以降低牛肉糜样品中变形菌门的比例,2个处理组样品较对照组样品的厚壁菌门均有所增加,丰度变化不大。此外,五香粉可以降低牛肉糜样品中拟杆菌门的比例,而蓝藻门仅在对照组中发现。
在属水平,所有样品都以环丝菌属为优势菌属,平均占比42.30%;假单胞菌属是第二大优势菌属,平均占比36.91%(图6b)。对照组、处理1组和处理2组样品中的环丝菌属占比分别为41.16%、42.78%和42.95%,假单胞菌属占比分别为42.33%、37.64%和30.75%。处理1组和处理2组的假单胞菌属比例较对照组分别降低4.69%和11.58%,而二者发光菌属的比例较对照组分别增加5.10%和7.39%。绿菌属仅在对照组中发现。
3 讨论
采用16S rRNA技术进一步分析香辛料对牛肉糜中微生物的影响。2种香辛料腌制牛肉糜的微生物群落丰富度均显著低于对照组(P<0.05),但菌落多样性比对照组高,值得注意的是,十三香粉对牛肉糜的影响比五香粉更大。可见,香辛料能改变牛肉糜微生物群落的丰富度,但对群落多样性影响较小。此外,不同香辛料对牛肉糜微生物群落的影响效果也不相同。在PCoA和层次聚类分析中,添加五香粉、十三香粉的牛肉糜样品与对照组的微生物群落组成有明显差异,且十三香粉对牛肉糜微生物群落结构的影响较五香粉更为明显,说明香辛料可以改变牛肉糜中微生物群落的组成。
在门水平上,3组样品的优势菌门相同,十三香粉组较对照组降低了变形菌门的比例,但提高了厚壁菌门和放线菌门的比例;五香粉组也有相似变化趋势,但不明显。可见,香辛料可以抑制牛肉糜在腌制过程中变形菌门的部分细菌增殖,这与香辛料的抗菌活性有关,此前研究也证实了这一点[24]。在属水平上,添加五香粉和十三香粉的牛肉糜较对照组明显降低了假单胞菌属的比例,说明香辛料能够抑制假单胞菌的生长,而假单胞菌是肉类中的主要嗜冷性腐败菌,具有很强的降解蛋白质和脂质的能力[25]。田凤等[26]研究发现,角茴香、丁香、肉桂等香辛料提取物对假单胞菌有显著抑制作用。香辛料中含有的多酚、黄酮化合物以及生物碱等物质具有抗菌和防腐特性[27]。Lazarevic等[28]的研究表明,当归精油能够破坏荧光假单胞菌的细胞壁结构和细胞膜完整性,导致内容物渗透而抑制荧光假单胞菌的生长,这是因为当归精油中富含柠檬烯、β-蒎烯和α-蒎烯等具有抗菌作用的成分。可见不同香辛料的抑菌效果不同。
LEfSe分析的分枝图结果显示,对照组存在显著差异的菌群最多(36个),添加五香粉和十三香粉的牛肉糜中存在显著差异的菌群分别为5个和3个,同时对照组和添加十三香粉牛肉糜中LDA值大于 4的生物标志物各有3个,由此可见香辛料对腌制牛肉糜的菌群结构有明显影响,这与上文分析结果一致。
4 结论
本文探究了复合香辛料(五香粉和十三香粉)腌制处理对牛肉糜品质及其微生物特性的影响,结果表明,2种香辛料均能够抑制牛肉糜中TVB-N值的上升和微生物的生长,且能改善牛肉糜的风味。16S rRNA结果进一步表明,香辛料可以抑制牛肉糜中常见细菌假单胞菌的繁殖,且十三香粉的抑菌效果优于五香粉。未来,可针对香辛料的优化组合及其腌制条件开展进一步研究。