光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种很有前景的细菌灭活方法,其能够对细菌的重要细胞成分造成不可修复的损伤,从而使细菌耐药性产生的可能性较小[1]。PDT是基于光敏剂(photosensitizer,PS)的光化学反应,光照激活PS从基态迁移到瞬态单激发态,然后迁移到延长的三重态,使PS与氧气或周围底物反应,产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。ROS是一个统称,描述了氧不完全还原时形成的化学物质,主要包括超氧阴离子(·O2-)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)和羟基自由基(·OH)[2]。高活性的ROS可诱导细菌细胞组分中的氧化应激,导致遗传毒性、脂质和蛋白质破坏、膜破坏和细菌死亡[1],可实现快速、高效和广谱抗菌。光催化杀菌技术因其易于获取和出色的能效而日益受到重视。Shen等[3]将硼二吡喃引入ZIF-8骨架,构建出一种可见光激发的新型纳米抗菌复合材料,实验结果表明,在LED灯照射下,复合材料的抗菌活性远远高于单独的ZIF-8。闫睿等[4]基于抗菌肽和卟啉光敏剂,使用溶剂热法合成构建出可靶向金黄色葡萄球菌的纳米光敏剂UBI/PCN-224,其在光照条件下可以产生1O2,从而达到对金黄色葡萄球菌的杀灭效果。可见,构建由可见光驱动的新型抗菌材料具有重要科学意义和应用前景。
光催化性能主要取决于催化剂的组分和结构,在过去几十年里,已经开发出多种光催化材料,如金属氧化物[5]、碳基材料[6]和金属有机框架(metal-organic frameworks,MOFs)等。在众多具有活性氧生成能力的纳米材料中,金属有机框架纳米材料引起广泛关注。MOFs是由金属中心(如金属离子或团簇)与有机配体通过配位键组成的一维、二维或三维结构的多孔材料[7]。相对于其他纳米材料,MOFs的最大优势在于较高的可设计性,较大的比表面积及可调节的功能金属离子、有机配体和多孔结构。另外,利用光催化分子作为有机配体的MOFs能够在光照条件下产生活性氧,显著提升其光催化抗菌效率,在光催化抗菌领域表现出独特优势[8-10]。
沸石咪唑酯金属有机骨架-8(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是目前研究最为广泛的一种MOFs材料,其由金属Zn2+作为中心,通过N原子与有机咪唑环配位组装形成多孔晶体材料[11],具有比表面积大、孔隙率高、孔径和尺寸可调、易于化学修饰、生物毒性小、稳定性优良等优势[12]。ZIF-8之所以可以作为杀菌材料使用,主要是因为它可以通过静电相互作用来破坏细胞膜(涉及Zn2+),且可以引起ROS产生[13]。然而,在实际抗菌应用中使用ZIF-8仍然是一个巨大挑战。ZIF-8的禁带宽,光吸收能力有限,仅在UV光下显示出高光动力学效率,无法产生足够的ROS用于抗菌应用[14-15]。此外,ZIF-8经常遭受光生空穴和电子对的快速复合,导致PDT效率低。合理改性能让ZIF-8更好地发挥可见光催化灭活能力。
后合成修饰是基于共价键作用,在合适的条件下,将特定的有机官能团与MOFs材料有机配体上可以发生共价反应的基团结合,从而获得直接合成法无法或难以得到的MOFs材料。氨基、羟基、羧基等基团是MOFs材料有机配体中常见的、易进行有机官能团后修饰的基团。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是茶叶中含量最高的一种特殊儿茶素,占茶多酚含量的40%~50%,占茶叶总质量的9%~13%。EGCG具有特殊的三维化学结构,具有6个邻位酚羟基,在抗菌、抗病毒、抗氧化和生物活性等方面优于其他儿茶素[16]。本研究使用EGCG对ZIF-8进行刻蚀,通过表面功能化修饰,引入羟基基团,合成EGCG@ZIF-8复合材料,进而研究其可见光催化活性及对金黄色葡萄球菌的杀菌效果。
1 实验方法
1.1 材料与仪器
ZIF-8,先锋纳米;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),麦克林;Luria-Bertani(LB)培养基,Difco;CM107-01营养琼脂,北京陆桥;ECM内皮细胞培养基,ScienCell;CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒,Biosharp;胰蛋白酶-EDTA,Gibco;DMEM培养基,Gibco;CEL-S500-T5 500 W氙灯,中教金源;CVE-3000离心浓缩仪,EYELA。
1.2 EGCG@ZIF-8材料的制备
采取后合成修饰的方法进行EGCG@ZIF-8材料制备[17]。称取一定质量的EGCG和ZIF-8分别溶于去离子水中,将溶解好的EGCG和ZIF-8按照1∶1的体积比混合,室温搅拌4 h, 然后在10 000r/min条件下离心30 min后去上清,将得到的固体用去离子水清洗3次,真空冷冻干燥,得到经EGCG修饰的ZIF-8材料,即EGCG@ZIF-8材料。
1.3 材料表征
利用一系列表征分析技术对2种材料(ZIF-8和EGCG@ZIF-8)进行表征。通过扫描电子显微镜(Quattors,赛默飞)和透射电子显微镜(JEM100CXII,日本电子)观察材料的微观形貌和粒径尺寸。通过傅里叶变换红外光谱(Nicolet 6700,赛默飞)扫描,分析材料表面官能团的变化。用X射线光电子能谱(ESCAlab 250Xi,赛默飞)表征样品表面的电子状态。采用电子顺磁共振波谱(JES-X310,日本电子)检测光催化杀菌时存在的活性组分。用光致发光光谱仪(F97 Pro,上海棱光)测量材料的光致发光载流子分离情况。利用紫外-可见漫反射光谱(UV-3600 Plus,日本岛津)探究材料的光学性质。
1.4 光催化杀菌实验
以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(ATCC 12600)为模式菌,用菌落计数法研究ZIF-8和EGCG@ZIF-8的抑菌性能。所有培养基和试剂均在121 ℃灭菌20 min,操作过程均在无菌操作台中进行,所用细菌是活化为指数期的菌株。
首先对实验菌种进行培养,将金黄色葡萄球菌置于LB液体培养基中,37 ℃、150 r/min条件下振荡培养12 h,将所得金黄色葡萄球菌母液用高温灭菌后的PBS缓冲液离心洗涤,离心机转速为8 000 r/min。收集得到的细菌后,使用PBS缓冲液将其稀释到所需浓度(106~107 CFU/mL)。
将实验设置为PBS、ZIF-8和EGCG@ZIF-8 3个处理组。将制备好的菌液添加到12孔细胞培养板中, EGCG@ZIF-8的最终质量浓度为0.5 mg/mL,细菌的最终浓度为106~107 CFU/mL,将12孔板置于500 W氙灯(400~780 nm,输出功率小于90 mW/cm2)下照射。在处理20、40、60 min时分别取样,吸取100 μL混合液均匀地分散在营养琼脂固体培养基中,37 ℃恒温孵育18~24 h。培养结束后根据形成的菌落数计算材料对金黄色葡萄球菌的杀菌率,杀菌率(L)使用公式L=lg(Ct/C0)进行计算,其中Ct和C0分别表示时间间隔t和0 min时的活菌浓度。
1.5 细菌核酸和蛋白质泄露检测
为进一步评估细菌细胞膜上诱导的损伤,检测与ZIF-8、EGCG@ZIF-8接触后细菌细胞中核酸和蛋白质的泄漏情况。将ZIF-8和EGCG@ZIF-8与金黄色葡萄球菌混合(材料的质量浓度为0.5 mg/mL),经光照60 min后离心取上清,用离心浓缩仪将上清液浓缩,检测其在260 nm和280 nm处的吸光度,分别对应于核酸和蛋白质的特征峰。
1.6 细胞增殖活力检测
使用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒评估材料的细胞毒性。将小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7和人脐静脉内皮细胞HUVEC在培养基中培养,并在37 ℃、含有5% CO2的受控环境中进行增殖。将生长良好的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(1×104)和人脐静脉内皮细胞HUVEC(7.5×103)接种到96孔板中,细胞黏附后分别加入质量浓度为0.5 mg/mL的ZIF-8和EGCG@ZIF-8,与细胞一起培养。在培养1、3、5 d时,每孔更换含有10% CCK-8溶液的培养基,孵育2 h后测量波长为450 nm的光密度值(OD),以确定相对细胞活力。
2 实验结果
2.1 EGCG@ZIF-8的形貌特征
使用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察ZIF-8、EGCG@ZIF-8的形貌。如图1所示,ZIF-8纳米颗粒的大小约为300 nm,形态为相对规则的十二面体,除个别出现团聚情况外,结构比较均匀。经EGCG刻蚀后的EGCG@ZIF-8形状接近不规则球形,这可能是由EGCG的刻蚀导致的[18]。由于多酚具有与金属配位的能力,EGCG的酚类单元首先被吸附到ZIF-8表面,原始的有机配体从外到内逐渐被取代,导致腐蚀过程[17]。此外,ZIF-8具有更清晰的颗粒性,而EGCG@ZIF-8则倾向于聚集,这是因为EGCG刻蚀使得ZIF-8尺寸变小,加重了聚集现象[17,19]。
2.2 X射线光电子能谱分析
通过X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析进一步研究ZIF-8和EGCG@ZIF-8复合材料的组成和表面化学状态。如图2所示,XPS全谱表明ZIF-8主要由Zn、N、O和C元素组成,经EGCG修饰后的EGCG@ZIF-8复合材料在化学成分上无明显变化,这可能是因为EGCG本身也主要由H、O和C元素组成。
2.3 傅里叶变换红外光谱分析
为验证ZIF-8经EGCG修饰后官能团的变化,对ZIF-8和EGCG@ZIF-8进行傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析,结果如图3所示。ZIF-8在420.89 cm-1处有1个属于Zn—N键的峰[20-21],在1 308.00 cm-1[20]和759.35 cm-1[21]处的2个峰代表咪唑环的振动拉伸,位于1 440~1 675 cm-1的峰归属于咪唑环上的C=N和C—N键[19-20,22 -24],位于2 200~3 300 cm-1的峰代表咪唑环的N—H能量[23-24],位于2 928.91 cm-1和3 135.74 cm-1处的峰是由C—H键引起的[19,22]。在EGCG@ZIF-8的光谱中也同样存在与ZIF-8相同的特征峰,与ZIF-8不同的是,EGCG@ZIF-8的光谱在3 377.28 cm-1处出现典型的酚羟基(—OH)峰[17,25],其原因可能是原属于表没食子儿茶素没食子酸酯上3 554.70 cm-1、3 477.08 cm-1、3 356.07 cm-1处的3个羟基吸收峰[26]在3 300~3 600 cm-1处合并为宽峰,表明ZIF-8上的Zn与EGCG的—OH或存在某些联系[17]。
2.4 材料的杀菌性能
2.5 材料的稳定性
稳定性是评价材料性能的重要指标。将反应后溶液中的材料与上清液分离,将材料置于紫外灯下照射以杀灭残存的金黄色葡萄球菌,随后再次加入金黄色葡萄球菌体系中重新进行杀菌实验,以此往复,对ZIF-8和EGCG@ZIF-8材料进行5次循环回收实验。实验结果如图5所示,ZIF-8在第1次循环中的杀菌率为99.17%,经过5次循环后,其杀菌率为96.21%,相比于初次使用,杀菌效果有所降低;而EGCG@ZIF-8复合材料在经过5次循环回收实验后,杀菌率依然稳定在99.999 9%,表明修饰后的复合材料具有较高的循环稳定性。
2.6 活性氧检测
光催化材料主要通过产生ROS达到杀菌目的[27-28]。为验证这一假设,采用电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)测定ZIF-8和EGCG@ZIF-8材料在可见光照射下产生ROS的种类(图6)。将2,6-二甲基吡啶-N-氧化物(DMPO)加入到ZIF-8和EGCG@ZIF-8体系中,作为·O2-和·OH的捕获剂,将4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)加入体系中用于捕获1O2[29]。在黑暗条件下,ZIF-8和EGCG@ZIF-8体系中均未出现ROS的特征峰。经可见光照射60 min后,ZIF-8测试体系中只出现TEMP-1O2的特征峰,而EGCG@ZIF-8测试体系中出现DMPO-·OH、DMPO-·O2-以及TEMP-1O2 3种特征峰。此外,EGCG@ZIF-8测试体系中的TEMP-1O2特征峰强度高于ZIF-8测试体系。以上结果表明,在可见光照射下,EGCG@ZIF-8比ZIF-8产生有更多的ROS,从而导致EGCG@ZIF-8的杀菌率高于ZIF-8。单一ZIF-8体系在光照条件下,也出现了1O2特征峰,这可能是ZIF-8体系在光照条件下对金黄色葡萄球菌具有一定杀菌效果的原因。
2.7 紫外-可见漫反射光谱分析
(αh)1/n=A(h-Eg)。
式中:α为吸收系数;h为普朗克常量;A为常数;Eg为吸收带隙能量;系数n由半导体光催化剂的光跃迁类型决定(n=2或n=0.5)。Tauc公式中的α可以用Kubelka-Munk函数F(R)代替,计算方法见公式(2):
F(R∞) = (1-R∞)2/2R∞。
2.8 光致发光光谱分析
2.9 细菌核酸和蛋白质的泄露
2.10 细胞增殖活性测定
3 结论
经EGCG刻蚀后,ZIF-8的形态由规则的正十二面体转变为不规则球形,出现明显聚集现象。FT-IR分析表明,EGCG与ZIF-8通过酚羟基形成化学键。在光催化抗菌性能方面,EGCG@ZIF-8在可见光下产生·O2-、1O2和·OH,对金黄色葡萄球菌的杀菌率可达99.999 9%,优于ZIF-8,并在5次循环实验中保持了高效杀菌性能,表现出良好的稳定性和可重复性。紫外-可见漫反射光谱和光致发光光谱分析表明,EGCG的引入使ZIF-8的禁带宽度降低至2.59 eV,光生载流子分离效率更高,可见光催化能力增强。细胞毒性实验显示,EGCG@ZIF-8复合材料具有良好的细胞相容性。以上结果证实EGCG@ZIF-8是一种具有潜在应用价值的光催化抗菌材料,未来可在环境治理领域探索其应用前景。