金纳米簇(AuNCs)具有合成简单、易于修饰、生物相容性好等优点[1]。然而,与量子点和有机染料等传统荧光材料相比,AuNCs较弱的荧光强度和较低的量子产率严重制约了其应用[2]。当前,聚集诱导发光增强(aggregation induced emission enhancement,AIEE)已被广泛研究并被认为是调节金属纳米簇荧光性质的一种可行策略[3]。常用的AIEE方法有溶剂诱导法[4]、金属离子诱导法[5]和聚合物诱导法[6]等。然而,当前制备具有AIEE特性的荧光纳米簇仍存在诸多不足,如有机溶剂和重金属离子引入、所得纳米材料形态不均、稳定性差等,严重限制了荧光纳米簇的进一步应用。因此,迫切需要开发一种易于操作、可控的AIEE策略以提高金属纳米簇的光致发光性能。
环糊精和葫芦[n]脲(CB[n])等大环分子的主客体识别功能已被广泛研究并应用于分析传感和纳米材料改性[7-9]。当前,大环分子仍较少用于增强金属纳米簇荧光。地塞米松是临床中应用最为广泛的糖皮质激素之一,具有抗炎、抗过敏、抗休克、免疫抑制等重要生理、药理作用。婴童对改善皮肤湿疹、瘙痒的护肤品需求较多,为谋取高额利润,存在一些不法商家在护肤品中违法添加糖皮质激素的现象,给儿童消费者带来健康风险。目前,已报道的地塞米松检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[10]、超高效液相色谱-质谱法(UHPLC-MS)[11]、核磁共振法(NMR)[12]等。尽管这些方法能够获得精确的检测结果,但需要昂贵的仪器设备及专业的操作人员,并不能用于现场即时检测,迫切需要开发针对地塞米松的即时检测方法。传统的基于主客体识别的荧光传感方法,其机制主要是通过靶标取代主体大环分子中结合荧光指示剂的模式实现荧光传感,该类方法依赖于有机荧光指示剂与大环分子结合和解离后的荧光变化,由于有机荧光指示剂发光相对较弱,致使该方法的灵敏度非常有限[13]。近年来,有研究人员将主客体识别与荧光纳米材料结合,可显著提高传感灵敏度[14],但尚未见AIEE金纳米簇与主客体识别结合应用于激素传感检测的报道。
因此,本研究基于主客体识别诱导制备具有聚集诱导荧光增强性质的金纳米簇自组装体,并将其应用于地塞米松传感。首先合成6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)封端的金纳米簇(ATT-AuNCs),再利用葫芦[7]脲(CB[7])对ATT分子的主客体识别作用,将小粒径的ATT-AuNCs聚集形成大粒径的金纳米簇自组装体CB[7]/AuNCs,并检测该CB[7]/AuNCs的荧光性能及其在地塞米松快速传感中的效果,旨在实现地塞米松的快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葫芦[7]脲(CB[7])、地塞米松购自上海麦克林生化科技有限公司;泼尼松龙、睾酮、孕酮、雌二醇、可的松购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸钠(Na2CO3)、硫酸钠、磷酸、硼酸、醋酸、氨水、丙氨酸、丝氨酸、组氨酸等购自国药集团化学试剂有限公司;氯金酸(HAuCl4)、罗丹明6G、胆固醇、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所用试剂均为分析纯,实验用水为Millipore制备的18.2 MΩ/cm超纯水。
1.2 仪器与设备
pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;傅里叶变换红外光谱仪,美国Nicolet公司;核磁共振氢谱仪,德国Bruker公司;透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM),日本电子株式会社;纳米粒度及Zeta电位仪,英国马尔文仪器有限公司;荧光分光光度计,上海棱光技术有限公司;紫外分光光度计,日本岛津公司;超快时间分辨荧光寿命仪,英国爱丁堡仪器公司;XPS光电子能谱仪,美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 实验方法
1.3.1 AuNCs和CB[7]/AuNCs的制备
ATT-AuNCs的合成:将ATT(80 mmol/L)溶解于3 mL的NaOH溶液(0.2 mol/L),再与3 mL的HAuCl4溶液(25 mmol/L)混合;在37 ℃、600 r/min条件下避光搅拌反应1 h,经超滤(Millipore,50 kDa)纯化(6 000 r/min,20 min)后得到ATT-AuNCs,于4 ℃条件下避光保存。
CB[7]/AuNCs的制备:将100 μL不同浓度的CB[7]溶液加入900 μL的ATT-AuNCs溶液中,混合均匀后于25 ℃条件下避光反应12 h,经超滤(Millipore,50 kDa)纯化(6 000 r/min,20 min)后得到不同浓度的CB[7]/AuNCs。
1.3.2 CB[7]/AuNCs对地塞米松的响应
以二甲基亚砜(DMSO)溶解地塞米松以制备不同浓度的地塞米松储备液。向180 μL的CB[7]/AuNCs溶液中添加20 μL不同浓度的地塞米松储备液,37 ℃条件下反应5 min,410 nm激发条件下记录溶液在450~650 nm的荧光光谱,以F/F0对地塞米松浓度构建标准曲线,F和F0分别为存在和不存在地塞米松情况下CB[7]/AuNCs在520 nm处的荧光强度。
1.3.3 地塞米松检测的选择性分析
用1.3.2相同的方法测试潜在干扰物,包括常见的类固醇(泼尼松龙、睾酮、孕酮、雌二醇、可的松)和护肤品中的常用活性成分(胆固醇、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、山梨醇、视黄醇、维生素C、维生素A、烟酰胺、熊果苷)。地塞米松和其他干扰物的最终物质的量浓度为10 mol/L。
1.3.4 实际样品中地塞米松的检测
从市场购买护肤膏试样,准确称取2 g(精确至0.01 g),置于15 mL离心管中,加入4 mL乙醇-水溶液(V乙醇∶V水=1∶1),涡旋混匀5 min,4 000 r/min离心5 min,上清液待用。吸取100 μL上清液于1 mL离心管中,加入900 μL磷酸盐缓冲液(pH为7.4,10 mmol/L),混匀后作为待测液。上述待测液经过提取净化后[11],使用1.3.2中的方法和LC-MS法同时检测,比较检测效果。
2 结果与讨论
2.1 CB[7]/AuNCs的AIEE效应
CB[n](n介于5~10)是一类大环受体分子,具有高度对称的疏水空腔,小分子可由上、下2个带有羰基的入口进入空腔。CB[n]结构具有刚性,能够与小分子和金属离子形成稳定复合物,是构建超分子传感体系的理想结构单元。ATT为一类胸腺嘧啶衍生物,可以与CB[7]发生主客体识别结合[14]。
本研究首先以ATT为封端配体和还原剂合成荧光较弱的ATT-AuNCs,再向ATT-AuNCs溶液中引入CB[7]溶液,一步合成CB[7]/AuNCs,通过透射电子显微镜观察CB[7]介导的聚集效应。透射电子显微镜图像如图1所示,可以看出,ATT-AuNCs分散良好,平均粒径约为3 nm,表明ATT-AuNCs制备成功。向ATT-AuNCs溶液中引入CB[7]后,ATT-AuNCs发生强烈聚集。在引入50 μmol/L CB[7]溶液后,ATT-AuNCs发生自组装,形成具有大颗粒的聚集体CB[7]/AuNCs,其平均粒径从3 nm增大到接近100 nm。
与此同时,CB[7]介导的聚集效应使CB[7]/AuNCs获得更加优异的荧光性能。如图3所示,随着CB[7]物质的量浓度的增加,CB[7]/AuNCs的荧光强度不断增加,在CB[7]物质的量浓度达到50 μmol/L时,荧光强度达到最大。相比于初始ATT-AuNCs,CB[7]/AuNCs的荧光强度增强了约15倍。这可能是金纳米簇呈现聚集态时,增加了Au(Ⅰ)-硫盐络合物之间的亲金相互作用,限制了纳米簇表面配体的振动和转动,降低了非辐射弛豫,从而产生聚集诱导发光增强(AIEE)效应[16]。ATT-AuNCs和CB[7]/AuNCs的荧光光谱均伴随轻微蓝移,这可能是由于AIEE效应使得原本金核内的亲金相互作用向金核间的亲金相互作用转变,从而产生更高的发射能量,发射波长蓝移[17]。
2.2 地塞米松检测的机理分析
在上述实验的基础上,对地塞米松诱导CB[7]/AuNCs荧光猝灭的潜在机理进行分析。Zeta电位分析结果如图4a所示,ATT-AuNCs表面带有负电荷,其电位为-1.99 mV;在修饰CB[7]后,电位降低至-3.63 mV;在加入地塞米松后,CB[7]/AuNCs的Zeta电位降至-4.06 mV,表明体系中各物质之间存在静电相互作用。
通过光谱分析进一步探究上述荧光猝灭的机理。由于CB[7]/AuNCs的荧光发射光谱与地塞米松的吸收光谱没有重叠,因此可以排除荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)效应。如图4b所示,CB[7]/AuNCs的激发光谱与地塞米松的吸收光谱略有重叠,表明体系中可能发生有荧光内滤效应(inner filter effect,IFE)。如图4c所示,在添加地塞米松后,CB[7]/AuNCs的荧光寿命从9.8 ns衰减至6.6 ns。通常来说,IFE的发生不会使荧光团的荧光寿命发生变化[18],因此IFE效应并不是荧光猝灭的主要原因。由图4d可见,地塞米松(40 μmol/L)的加入使CB[7]/AuNCs的平均粒径显著下降到36 nm左右,即存在靶标诱导解聚现象。
采用荧光滴定对比分析CB[7]与ATT-AuNCs表面ATT配体及地塞米松的结合。由图5可以看出,CB[7]-地塞米松的结合常数远高于CB[7]-ATT,这为CB[7]/AuNCs特异性识别地塞米松提供了良好的基础。如前所述,地塞米松分子能够以高亲和力与CB[7]结合,因此推测地塞米松诱导纳米簇自组装体荧光猝灭的主要原因是地塞米松分子与ATT配体分子竞争结合CB[7]空腔,导致CB[7]/AuNCs的聚集结构分解。
2.3 地塞米松的检测性能
为确定地塞米松检测的最佳反应条件,根据520 nm处的1-F/F0值,对传感系统的反应温度和反应时间进行优化。如图6a、图6b所示,将地塞米松与CB[7]/AuNCs在37 ℃条件下反应5 min即可获得最佳荧光响应。以此为基础,构建地塞米松的荧光检测系统。如图6c、图6d所示,随着地塞米松物质的量浓度的增加,CB[7]/AuNCs的荧光逐渐猝灭,其F/F0值与地塞米松物质的量浓度的对数在0.05~40 μmol/L范围内呈现良好的线性关系,根据3σ/s(σ是空白对照的标准偏差,s是线性方程的斜率)计算出地塞米松的检测限(limit of detection,LOD)为22 nmol/L(8.6 ng/mL)。尽管与已有的地塞米松快速免疫层析检测方法相比[19],本方法灵敏度低大约一个数量级,但本方法的材料制备非常简便,且不依赖抗体生物分子识别。此外,护肤品中非法添加的地塞米松药效浓度一般要达到常量水平[20],该方法的灵敏度可满足其快速检测需求,在现场即时检测中具有一定的竞争优势。
2.4 地塞米松的选择性与实际样品检测
为评估所构建的地塞米松检测方法的特异性,选取常见的类固醇,包括泼尼松龙、睾酮、孕酮、雌二醇、可的松,及护肤品中的常用物质,包括胆固醇、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、山梨醇、视黄醇、维生素C、维生素A、烟酰胺、熊果苷等作为潜在干扰物质,采用所建立的荧光检测方法进行检测,所有潜在干扰物质的物质的量浓度均为10 μmol/L。如图7所示,地塞米松能够有效猝灭CB[7]/AuNCs的荧光,而干扰物质对传感系统的影响有限,二者能够被明显区分,表明该检测方法对地塞米松具有优异的选择性。
将该荧光检测方法应用于护肤膏阴性样品的检测,对于添加物质的量浓度为1.0、10、40 μmol/L的地塞米松样品,所得回收率为98.5%~104.6%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为3.2%~4.3%(表1)。与LC-MS方法的检测结果相比,该方法的检测结果具有较高相符性。因此,该方法具备对实际样品中地塞米松检测的良好性能。
表1 护肤膏中地塞米松的回收结果(n=3)Tab.1 Recovery results of dexamethasone from skin cream samples(n=3) |
| 加标量/ (μmol·L-1) | 所建方法 | LC-MS方法 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 检出量/ (μmol·L-1) | 回收率/% | RSD/% | 检出量/ (μmol·L-1) | 回收率/% | RSD/% | |||||||
| 0 | 0 | 0 | ||||||||||
| 1.0 | 1.04 | 104.0 | 3.8 | 0.90 | 90.0 | 5.1 | ||||||
| 10 | 10.46 | 104.6 | 4.3 | 9.27 | 92.7 | 3.9 | ||||||
| 40 | 39.40 | 98.5 | 3.2 | 38.60 | 96.2 | 2.8 | ||||||
3 结论
本研究成功制备出一种具有出色聚集诱导荧光增强效应的金纳米簇聚集体CB[7]/AuNCs,该CB[7]/AuNCs可通过CB[7]与地塞米松结合,诱导其解聚集,导致纳米簇聚集体荧光淬灭。基于此机制,建立了一种灵敏且快速的地塞米松荧光传感方法,该方法的检测限为22 nmol/L,线性范围为0.05~40 μmol/L,可应用于护肤品中地塞米松的快速检测。