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2025 , Vol. 53 >Issue 3: 66 - 82

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2025206

Research on water extraction process of compound Juncao Ganoderma lucidum granules and the formulation of quality standard

  • ZHANG Guiqing , 1, * ,
  • LIANG Zhihao 1 ,
  • LIU Qing 1 ,
  • WU Xiaoping 1 ,
  • LUO Hailing 1 ,
  • YAO Junxin 1 ,
  • LIU Bin 1, 2 ,
  • LIN Zhanxi 1 ,
  • JIANG Shusong 3
Expand
  • 1 National Research Center for Juncao Engineering, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
  • 2 College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
  • 3 Fujian Chanyi Tea Path Agricultural Comprehensive Development Co., Ltd., Longyan 364200, Fujian, China

Received date: 2024-12-02

  Online published: 2025-06-23

Fold

Abstract

In order to explore the water extraction process and quality standard of compound Juncao Ganoderma lucidum granules, liquid extract yield and liquid extract polysaccharide content were taken as indexes, the effects of extraction temperature, extraction time, ratio of material to liquid, extraction times and soaking time on extraction yield and polysaccharide content were investigated by single factor and response surface experiments. The particle size, moisture content, weight loss on drying, loading difference, solubility, microbial limit and heavy metal content of granules were detected according to the 2015 edition of Pharmacopoeia of the People’s Republic of China and the national standard. The raw materials of Juncao Ganoderma lucidum, Perilla frutescens and selenium-enriched tea in compound Juncao Ganoderma lucidum granules were identified by thin layer chromatography, and the contents of monosaccharides and tea polyphenols in compound Juncao Ganoderma lucidum granules were determined through high performance liquid chromatography. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: extraction temperature 80 ℃, extraction time 2.5 h, ratio of material to liquid(g/mL) 1∶25, two times of extraction, and immersion time 6 h. The particle size, water content, solubility, weight loss on drying and loading difference of the granules reached the requirements of the 2015 edition of Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.The microbial limit and heavy metal content of the granules met the requirements of the national standard, and the average selenium content was 0.058 3 mg/kg. The TLC bands of Juncao Ganoderma lucidum, Perilla frutescens and selenium-enriched tea were clear and well separated, with no interference from the negative control. The contents of mannose, rhamnose, glucose, galactose, arabinose, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate, catechin, gallic acid in compound Juncao Ganoderma lucidum granules were 1.310, 1.166, 8.708, 1.265, 0.824, 5.79, 2.58, 1.72 and 1.67 mg/g, respectively. The optimized water extraction process of the compound Juncao Ganoderma lucidum granules is stable and reliable, all the indexes of the granules meet the requirements, and the established quality standard for the water extraction process of compound Juncao Ganoderma lucidum granules is feasible.

Key words： Juncao Ganoderma lucidum; water extraction process; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography; quality standard

Cite this article

ZHANG Guiqing , LIANG Zhihao , LIU Qing , WU Xiaoping , LUO Hailing , YAO Junxin , LIU Bin , LIN Zhanxi , JIANG Shusong . Research on water extraction process of compound Juncao Ganoderma lucidum granules and the formulation of quality standard[J]. Journal of Shaanxi Normal University(Natural Science Edition), 2025 , 53(3) : 66 -82 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2025206

复方菌草灵芝颗粒由菌草灵芝、紫苏和富硒茶通过超声水提和湿法制粒制成,其中菌草灵芝含有灵芝多糖[1]、灵芝酸[2]和灵芝三萜[3]等活性成分,具有调节免疫[4]、降低血糖和血脂[5]、抗肿瘤[6]等多种功效;紫苏含有紫苏挥发油[7]、黄酮、紫苏醛[8]、花色苷[9]等活性成分,具有抗菌消炎[10]、抗氧化[11]、抗肿瘤[12]作用;富硒茶含有茶多酚[13]、茶多糖[14]和硒[15]等有效成分,具有调节免疫[16]、抗疲劳和抗肿瘤[17]作用。对灵芝、紫苏和富硒茶的活性成分、生理活性和药理活性的相关研究有很多,灵芝及其活性成分经过深加工后,已被广泛添加到食品和药品中。灵芝、紫苏和富硒茶均含有调节人体免疫功能、抗肿瘤等活性成分,如多糖、黄酮和多酚类物质,将三者组成复方制剂存在合理性。目前,研究人员只对其中一种药材或两种药材的药理效果进行过研究,尚未见报道将菌草灵芝、富硒茶和紫苏按照一定比例制成颗粒剂。随着我国经济社会的快速发展,生活压力、工作压力、环境污染和食品安全等问题使很多人群长期处于亚健康或免疫力低下状态[18],增加了人们对增强免疫力产品的需求。
灵芝多糖为复方菌草灵芝干浸膏的最主要活性成分之一。它的传统提取方法主要是浸提法,其首先对样品进行热水浸提,再醇沉得到灵芝多糖成分。传统方法利用了灵芝多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点,从不同材料中进行提取。该方法操作简单,但存在提取纯度低、所需溶剂较多等弊端[19]。目前,中药材工厂化提取仍然采用水煎煮法,耗时长、成本高。水提工艺作为颗粒制备的前提步骤直接影响颗粒的生产成本和品质。提取过程中,多种化学物质的加入不仅会造成灵芝多糖活性物质的流失,废液废料的处理也容易对环境造成污染。传统方法的诸多问题严重制约了灵芝多糖的提取质量,而且很难实现高效和环境安全的目标。近十几年来,针对传统中药提取工艺能耗大、有效成分损耗大、杂质多、效率低等问题,在中药提取工艺与设备方面的研究有了较大进展,出现了一些新方法、新工艺和新设备,对提高中药有效成分提取率、降低物耗等有显著作用和优势,有着广阔的研究和应用前景[20]。与传统水煎煮法相比,超声波辅助提取利用超声波具有的机械效应、空化效应和热效应,增大介质分子的运动速度和介质穿透力,更有利于中药材活性成分溶出,提高有效成分提取率[21]。
本研究采用超声波辅助提取的方式对菌草灵芝、紫苏和富硒茶复合物进行提取,通过单因素和响应面法探究复方菌草灵芝颗粒的水提工艺,并参考《中国药典》及国标中颗粒剂的检测方法和质量控制方法对颗粒质量进行探究,采用高效液相色谱法和薄层色谱法对颗粒中的成分进行定性定量分析[22],建立复方菌草灵芝颗粒的质量标准,为复方菌草灵芝颗粒的有效性、安全性和质量稳定性提供保障,为其进一步开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌草灵芝,福建省菌芝堂生物科技有限公司;紫苏叶,亳州市永刚饮片厂有限公司;富硒红茶,湖南省新山茶业有限公司;表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG),上海子其生物科技有限公司;硅胶G薄层板,青岛海洋化工有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC紫外可见分光光度计,上海昂拉仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵,河南省予华仪器有限公司;SJIA-10N-A冷冻干燥机,宁波市双嘉仪器有限公司;LC310液相色谱仪,广州科晓科学仪器有限公司;GD0615超声波清洗机,深圳市超洁科技实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 复方菌草灵芝颗粒的制备

按照课题组先前优化的配方,称取烘干后的菌草灵芝17.7 g、富硒茶12.3 g、紫苏1.27 g,按料液比(g/mL)1∶20加入蒸馏水,浸泡4 h,80 ℃水浴超声2.5 h(超声功率360 W,加热功率450 W,频率40 kHz),过滤。按上述条件复渣1次,合并滤液。65 ℃真空减压浓缩,冷冻干燥,得到复方菌草灵芝颗粒。

1.3.2 复方菌草灵芝颗粒水提工艺单因素实验

1)料液比对浸膏得率和多糖含量的影响
称取5份复方菌草灵芝颗粒原料,分别按料液比(g/mL)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入蒸馏水,其余步骤同1.3.1,计算浸膏得率和多糖含量。
2)提取温度对浸膏得率和多糖含量的影响
称取5份复方菌草灵芝颗粒原料,分别在50、60、70、80、90 ℃条件下超声提取,其余步骤同1.3.1,计算浸膏得率和多糖含量。
3)浸泡时间对浸膏得率和多糖含量的影响
称取5份复方菌草灵芝颗粒原料,分别浸泡0、1、2、3、4、5、6、7、8 h,其余步骤同1.3.1,计算浸膏得率和多糖含量。
4)提取时间对浸膏得率和多糖含量的影响
称取5份复方菌草灵芝颗粒原料,分别按0.5、1.5、2、2.5、3 h 超声提取,其余步骤同1.3.1,计算浸膏得率和多糖含量。
5)提取次数对浸膏得率和多糖含量的影响
称取3份复方菌草灵芝颗粒原料,分别提取1次、2次和3次,其余步骤同1.3.1,计算浸膏得率和多糖含量。
6)浸膏得率和多糖含量测定
参考赵晶晶[23]的方法测定复方菌草灵芝颗粒中的多糖含量,得到葡萄糖的标准曲线方程为y=0.062 4x+0.018 7(R2=0.991)。按照下列公式计算颗粒中浸膏得率和多糖含量:
R= M n M 0×100%,
W1= C o V M n×100%。
式中:R为浸膏得率;Mn为浸膏质量;M0为复方菌草灵芝颗粒原料质量;W1为浸膏多糖质量分数(含量);Co为待测样品多糖质量浓度;V为待测样品体积。

1.3.3 复方菌草灵芝颗粒水提工艺响应面实验

根据单因素实验结果,选取对浸膏得率和多糖含量影响较大的3个因素提取温度A(60、70、80 ℃)、提取时间B(2、2.5、3 h)和料液比C(1∶15、1∶20、1∶25),设计三因素三水平实验。以浸膏得率和多糖含量为指标,参照李琳等[24]的方法对浸膏得率和多糖含量的权重系数进行分配,获得综合评分作为响应值。综合评分计算公式如下:
综合评分= 浸 膏 得 率 最 大 浸 膏 得 率×50+ 浸 膏 多 糖 含 量 最 大 浸 膏 多 糖 含 量×50。

1.3.4 复方菌草灵芝颗粒质量标准研究

1)粒度 取同一天做的三批次颗粒第1批次、第2批次、第3批次各21 g,按照2015版《中国药典》颗粒剂粒度和粒度分布法测定样品颗粒粒度。
2)水分含量 取三批次颗粒各5份,每份4 g,100 ℃干燥5 h,冷却10 min,精密称重,重复2次,2次测量结果差异小于5 mg,计算水分含量。
3)可溶性 取三批次颗粒各10 g,加入沸水100 mL,记录颗粒的完全溶化时间,同时观察其溶解情况。
4)干燥失重率 取三批次颗粒各3份,每份1 g,置于锥形瓶中,70 ℃干燥20~30 h,计算颗粒的干燥失重率。
5)装量差异 取第1批次颗粒10袋,去除包装物,称量每份颗粒的质量,计算10份颗粒的平均装量及装量差异。
6)微生物限量 根据国标GB4789.10—2016、GB4789.3—2016、GB4789.15—2016、GB4789.4—2016的方法测定样品中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霉菌、沙门氏菌的菌落数量及菌落总数。
7)重金属含量 参照国标GB 5009.12—2010、GB 5009.17—2021、GB 5009.11—2003的方法检测样品中铅、汞、砷的含量。
8)硒含量检测 参照国标GB5009.93—2017的方法测定样品中的硒含量[25]。
9)灵芝的薄层色谱鉴定[26] 称取复方菌草灵芝颗粒10 g于锥形瓶中,加入乙醇65 mL,密塞,60 ℃、300 W超声60 min,过滤,醇提液浓缩至干,残渣加入2 mL甲醇溶解,配制成供试品溶液。将菌草灵芝对照药材粉碎,过80目筛,取2 g细粉,同法制成对照药材溶液。制备复方中除灵芝以外的颗粒制剂,按照上述方法制备成阴性对照溶液。吸取上述溶液各10 μL,供试品溶液做3个重复,用毛细管少量多次点于硅胶G薄层板上。展开液按照V石油醚∶V甲酸乙酯∶V甲酸=14.5∶5.6∶1.5配制,展开,薄层板干后紫外可见分光光度计观察,波长为365 nm。
10)紫苏的薄层色谱鉴定[27] 取复方菌草灵芝颗粒8 g于锥形瓶中,加入80 mL乙醇,密塞,70 ℃、300 W超声60 min,过滤,醇提液浓缩至干,残渣加入2 mL甲醇溶解,配制成供试品溶液。将紫苏对照药材粉碎,过80目筛,称取1 g,同法制成对照药材溶液。制备除紫苏以外的复方颗粒,按照上述方法制备成阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μL,用毛细管少量多次点于硅胶G薄层板上。展开液按照V乙酸乙酯∶V甲醇∶V甲酸∶V水=10∶0.4∶1.2∶0.6配制,展开,薄层板干后喷10%的硫酸乙醇适量,105 ℃加热至显色清晰,紫外可见分光光度计观察,波长为365 nm。
11)富硒茶的薄层色谱鉴定[28] 称取复方菌草灵芝颗粒10 g于锥形瓶中,加入65 mL乙醇,密塞,70 ℃、300 W超声60 min,过滤,醇提液浓缩至干,残渣加入2 mL甲醇溶解,制备成供试品溶液。取富硒茶1 g,按照上述方法制备成富硒茶对照品溶液。取EGCG、ECG各1 mg,分别加甲醇1 mL,制备成EGCG、ECG对照品溶液。制备除富硒茶以外的复方颗粒,按照上述方法制备成阴性对照溶液。吸取以上溶液各5 μL,用毛细管少量多次点于硅胶G薄层板上。展开液按照V甲苯∶V丙酮∶V甲酸=9∶9∶2配制,展开,薄层板干后密闭容器内碘熏30 s,紫外可见分光光度计观察,波长为254 nm。
12)单糖含量测定[29] 色谱条件:采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱子(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈(A)、乙酸铵(B)为流动相,检测波长250 nm,进样体积20 μL,流速1 mL/min,温度30 ℃。洗脱梯度如下:0~42 min,15% A,85% B;42~43 min,15%~13% A,85%~87% B;43~54 min,13% A,87% B;54~60 min,13%~15% A,87%~85% B。
混合标准品溶液配制:称取D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖各5 mg,置于10 mL量瓶中,配制成质量浓度为0.5 mg/mL的混合标准品溶液。吸取上述溶液0.5 mL加入0.4 mol/L NaOH 0.5 mL,65 ℃反应170 min,冷却至室温后加入0.4 mol/L HCl 0.5 mL,混合均匀,继续加入氯仿2 mL,相同步骤萃取3次,取上清,得混合标准品衍生化溶液。
供试品溶液配置:取颗粒于研钵中碾碎,过筛,称取2 g于锥形瓶中,加入80%乙醇60 mL,密塞,70 ℃、360 W超声3 h,抽滤,沉淀物用70 ℃超纯水溶解,定容至50 mL,4 000 r/min离心8 min,取上清1 mL,加入4 mol/L HCl 0.6 mL,酸水解温度为110 ℃,反应150 min,冷却10 min后加入4 mol/L NaOH溶液适量,使得溶液pH为中性,即得到供试品水解液。继续按照前述步骤进行衍生化得到供试品衍生化溶液。
阴性对照溶液配制:制备除灵芝、富硒茶以外的复方颗粒,按照前述方法制备成阴性对照溶液。
可行性验证:按照上述色谱条件,取上述3种溶液分别进样,考察方法的专属性。将上述混合标准品溶液配置成质量浓度范围为0.1~0.5 mg/mL的标品溶液,并进行衍生化,以标准品质量浓度为X轴,以各单糖峰面积为Y轴,绘制标准曲线,考察线性关系。吸取质量浓度为0.3 mg/mL的混合标准品溶液进样5次,考察方法的精密度。取同批次颗粒5份,制备成5份供试品溶液分别进样,考察方法的重复性。取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8、10 h进样,考察方法的稳定性。取已知各单糖含量的同一批次样品4份,加入不同质量浓度的混合标准品,制成待测溶液分别进样,计算回收率。
13)多酚含量测定 色谱条件:采用Kromasil S C18柱子(250 mm×4.6 mm,5 μm),测定波长278 nm,按照国家标准GB/T 31740.2—2015中对茶多酚类物质的检测方法配制流动相A混合体系(A)、流动相B混合体系(B)和稳定溶液,柱温30 ℃,进样体积10 μL,流速1 mL/min。洗脱梯度如下:0~10 min,100% A,0 B;10~25 min,100%~68% A,0~32% B;25~35 min,68% A,32% B;35~45 min,68%~100% A,32%~0 B。
混合标准品溶液配制:准确称取EGCG 10 mg、ECG 4 mg、儿茶素5 mg、没食子酸3 mg,用50%甲醇定容至10 mL,得到混合标准品溶液。
供试品溶液配制:取复方菌草灵芝颗粒于研钵中碾碎,过80目筛,称取2 g加入甲醇20 mL,超声60 min,定容至25 mL。
阴性对照溶液配制:制备除灵芝、富硒茶以外的复方颗粒,按照前述方法制备成阴性对照溶液。
可行性验证:配制不同质量浓度的混合标准品溶液,以标准品质量浓度为X轴,峰面积为Y轴,绘制标准曲线,考察线性关系。吸取单一混合标准品溶液重复测定5次,考察方法的精密度。取同一批次复方菌草灵芝颗粒5份,制备成5份供试品溶液,测定其EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸含量,考察方法的重复性。取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10 h进样,考察方法的稳定性。取同一批次已知EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸含量的颗粒4份,加入2种不同质量浓度的混合标准品,制备成待测溶液分别进样,计算回收率。

1.4 数据处理

每组数据重复测定3次,结果以平均值±标准差进行表示。采用SPSS 18.0和Prism软件进行数据处理和统计学分析,使用Office 2010进行t检验,采用Origin 8.0软件作图。响应面实验用Design-Expert 8.0.6 软件进行参数优化和方差分析。

2 结果与分析

2.1 水提工艺单因素实验结果

2.1.1 料液比对浸膏得率和多糖含量的影响

由图1可知,当料液比(g/mL)介于1∶10~1∶25时,随着料液比的增大,浸膏得率和多糖含量逐渐增加;当料液比(g/mL)从1∶25增加到1∶30时,浸膏得率和多糖含量无明显增加。推测随着料液比的提升,多糖浓度降低,这显著扩大了细胞内外的多糖浓度差,增强了传质推动力,促使多糖向水中扩散,因而浸膏得率和多糖含量得以提升。但当料液比升至一定值后,溶剂中的多糖量达到最大值,继续增加料液比无法继续提高溶剂中多糖的量,反而降低多糖的稳定性,导致浸膏得率和浸膏多糖含量趋于稳定[30]。考虑到生产成本,选择1∶25为最适料液比(g/mL)。
图1 料液比对浸膏得率和多糖含量的影响

Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction yield and polysaccharide content

2.1.2 提取温度对浸膏得率和多糖含量的影响

由图2可知,当提取温度介于50~80 ℃时,随着温度的升高,浸膏得率和多糖含量快速增加, 温度为80 ℃时浸膏得率和多糖质量分数达到最大,分别为13.13%和19.05%,此后温度继续增加,浸膏得率和多糖含量逐渐下降。这可能是因为80 ℃之前,随着提取温度的升高液体介质的表面张力和黏度降低,蒸汽压增加,液体介质之间容易拉开而形成空化气泡,空化作用使得细胞破坏程度增大,促进细胞多糖向外扩散,导致浸膏得率和多糖含量升高。此后温度继续增加,多糖提取接近饱和,而样品中其他成分也被提取出来,杂质含量增加,致使浸膏得率和多糖含量下降[31];此外, 也可能是温度过高使得部分水溶性多糖分解,对温度敏感的多糖结构遭到破坏所致[32]。
图2 提取温度对浸膏得率和多糖含量的影响

Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield and polysaccharide content

2.1.3 浸泡时间对浸膏得率和多糖含量的影响

由图3可知,随着浸泡时间的增加,浸膏得率和多糖含量逐渐增加,浸泡6 h时浸膏得率为12.32%,多糖质量分数为18.04%。此后浸泡时间继续增加,浸膏得率和多糖含量无明显增加。浸泡 0 h和8 h的浸膏得率和多糖含量分别相差2.06%和2.24%,说明浸泡时间对浸膏得率和多糖含量影响不显著。考虑到实际生产应用,选择6 h为最适浸泡时间。
图3 浸泡时间对浸膏得率和多糖含量的影响

Fig.3 Effect of soaking time on the extraction yield and polysaccharide content

2.1.4 提取时间对浸膏得率和多糖含量的影响

由图4可知,浸膏得率和多糖含量在超声提取0.5~2.5 h内逐渐提高,超声2.5 h时浸膏得率和多糖质量分数达到最大,分别为12.45%和20.42%,提取3 h时,浸膏得率和多糖含量反而下降。其原因可能是:灵芝所含多糖短时间内不能完全释放,超声初期细胞破碎,细胞多糖不断溶出,随着提取时间的延长,较多的多糖溶解并释放到溶质中,多糖含量提高;但随着超声时间的继续增加,部分多糖被分解,多糖结构遭到破坏,灵芝颗粒表面对提取物的吸附力增强,使得浸膏得率和多糖含量有所下降[31,33-35]。
图4 提取时间对浸膏得率和多糖含量的影响

Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield and polysaccharide content

2.1.5 提取次数对浸膏得率和多糖含量的影响

由图5可知,对比提取1次,提取2次的浸膏得率和多糖含量显著增加;提取3次与提取2次相比,浸膏得率和多糖含量无显著变化。其原因可能是前2次提取时,大部分多糖已经释放到溶质中,连续多次提取使多糖结构被破坏或者溶液变黏稠,多糖溶出困难[36]。考虑到生产成本,选取2次为最适提取次数。
图5 提取次数对浸膏得率和多糖含量的影响

Fig.5 Effect of extraction times on theextraction yield and polysaccharide content

2.2 水提工艺响应面实验结果

采用Design-Expert 8.0.6软件,建立数学模型优化水提工艺参数,实验结果见表1和表2。对综合评分结果进行二次多元拟合,得到综合评分结果对A、B、C的模型方程:Y=86.24+5.20A+2.49B+1.64C-2.26AB+2.71AC+0.7BC-2.31A2-3.45B2+3.08C2,其R2=0.809 3,P值为0.004 9,失拟项P值为0.068 2,表明所建立的水提工艺综合评分模型与实际实验结果拟合良好,该模型成立。
表1 响应面实验结果

Tab.1 Response surface experiment results

序号 提取温度A 提取时间B 料液比C 浸膏得率/% 多糖质量分数/% 综合评分
1 -1 -1 0 8.756 15.058 68.42
2 1 -1 0 12.774 16.652 86.75
3 -1 1 0 10.223 17.106 78.72
4 1 1 0 13.940 15.471 88.03
5 -1 0 -1 12.012 16.484 83.61
6 1 0 -1 11.655 17.632 85.15
7 -1 0 1 11.237 17.541 83.44
8 1 0 1 12.774 20.340 95.82
9 0 -1 -1 11.475 17.364 83.84
10 0 1 -1 12.692 16.705 86.59
11 0 -1 1 11.447 17.362 83.74
12 0 1 1 12.215 18.503 89.30
13 0 0 0 11.847 18.235 87.32
14 0 0 0 11.472 18.267 86.05
15 0 0 0 11.312 17.817 84.37
16 0 0 0 11.729 18.653 87.92
17 0 0 0 11.286 18.322 85.52
表2 响应面回归模型方差分析

Tab.2 Variance analysis of response surface regression model

参数 离差平方 自由度 均方 F P 显著性
模型 446.97 9 49.66 8.54 0.004 9 **
A 215.90 1 215.90 37.14 0.000 5 **
B 49.45 1 49.45 8.51 0.022 4 *
C 21.48 1 21.48 3.70 0.096 0
AB 20.34 1 20.34 3.50 0.103 6
AC 29.38 1 29.38 5.05 0.059 4
BC 1.97 1 1.97 0.34 0.578 3
A2 22.45 1 22.45 3.86 0.090 1
B2 50.02 1 50.02 8.61 0.021 9 *
C2 39.90 1 39.90 6.86 0.034 4 *
残差 40.69 7 5.81
失拟项 32.65 3 10.88 5.41 0.068 2
纯误差 8.04 4 2.01
总离差 487.66 16

注:*、**分别表示差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01)。

由表2可知,提取温度对综合评分模型具有极显著影响(P<0.01),超声时间对综合评分模型具有显著影响(P<0.05),料液比的影响不显著,AB、AC、BC和A2影响不显著,B2和C2具有显著影响(P<0.05),结合F值判断3个因素的影响顺序由大到小依次为提取温度、提取时间、料液比。
3个因素在响应面中的相互作用可由图6进行判断。如图6a、6b所示,提取温度和提取时间因素作用增大时,综合评分逐渐增大,随着2个因素的相互作用,综合评分增加幅度减小,其中提取温度面坡度较大,等高线相对密集,结合方差分析(表2),说明提取温度对实验结果的影响大于提取时间。对比图6c和6d、6e和6f的响应面陡峭程度、等高线间距及密集程度,结合方差分析结果,进一步证实3个因素对实验结果的影响由大到小依次为提取温度、提取时间、料液比。
图6 响应面图和等高线图

注:网络版为彩图。

Fig.6 Response surface diagrams and contour curves

通过对响应面实验结果进行分析,得到复方菌草灵芝颗粒的最佳水提工艺理论条件:超声提取温度为80 ℃、超声提取时间为2.5 h、料液比(g/mL)为1∶25。按照上述水提工艺进行3组平行实验,得到3次水提工艺的综合评分分别为97.11、96.75和96.83,与预测值96.61接近,相对误差分别为0.52%、0.14%和0.23%,表明得到的复方菌草灵芝颗粒最佳水提工艺稳定可靠。

2.3 复方菌草灵芝颗粒质量标准研究结果

2.3.1 颗粒性状及粒度

复方菌草灵芝颗粒呈黄褐色,气微香、味略苦。3批次颗粒的粒度分别为7.98%、8.31%、7.48%,均小于2015版《中国药典》规定值15%。

2.3.2 水分含量、可溶性及干燥失重

3批次复方菌草灵芝颗粒的水分含量分别为3.92%、3.86%、4.05%,远低于2015版《中国药典》规定值8%。3批次颗粒均在1 min内完全溶解,对照2015版《中国药典》标准,其可溶性符合要求。3批次颗粒的平均干燥失重率分别为1.38%、1.34%、1.45%,均小于规定值2%,干燥失重率合格。

2.3.3 颗粒装量差异

复方菌草灵芝颗粒的标示装量为10 g,2015版《中国药典》明确规定:颗粒的标示装量大于6 g时,装量差异不能超过±5%。由表3可知,复方菌草灵芝颗粒的3批次装量差异均小于±5%,装量差异合格。
表3 复方菌草灵芝颗粒的装量差异

Tab.3 Loading amount difference of compound Juncao Ganoderma lucidum granules

测试次数 一批次装量/g 装量差异/% 二批次装量/g 装量差异/% 三批次装量/g 装量差异/%
1 10.141 1.41 10.214 2.14 10.268 2.68
2 9.872 -1.28 9.896 -1.04 10.143 1.43
3 10.255 2.55 9.972 -0.28 10.056 0.56
4 10.174 1.74 10.048 0.48 9.897 -1.03
5 9.816 -1.84 10.251 2.51 10.143 1.43
6 10.193 1.93 10.223 2.23 10.245 2.45
7 10.121 1.21 9.877 -1.23 10.176 1.76
8 10.147 1.47 9.930 -0.70 9.841 -1.59
9 9.945 -0.55 10.157 1.57 9.912 -0.88
10 9.860 -1.40 10.314 3.14 10.217 2.17

2.3.4 微生物限量、重金属及硒含量

3批次复方菌草灵芝颗粒中大肠杆菌、霉菌和金黄色葡萄球菌的菌落数量及菌落总数均小于规定值10 CFU/g,未检出沙门氏菌,符合国标相关规定。
国标对食品中汞含量的要求为小于0.1 mg/kg,对铅含量的要求为小于1.0 mg/kg。由表4可知,3批次复方菌草灵芝颗粒的汞含量和铅含量均符合要求,无砷检出。
表4 复方菌草灵芝颗粒中的重金属和硒含量

Tab.4 Contents of heavy metals and selenium in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

批次 汞含量/(mg·kg-1) 铅含量/(mg·kg-1) 砷含量/(mg·kg-1) 硒含量/(mg·kg-1)
第1批次 <0.01 0.26 未检出 0.053
第2批次 <0.01 0.20 未检出 0.064
第3批次 <0.01 0.21 未检出 0.058
因配方中含有富硒茶,对3批次样品中的硒含量进行检测,分别为0.053、0.064、0.058 mg/kg,平均硒含量为0.058 mg/kg,表明复方菌草灵芝颗粒富含硒元素,可作为人体硒元素的膳食补充剂。

2.3.5 灵芝、紫苏、富硒茶薄层色谱鉴别

由图7可以看出,紫外灯下,在同一水平线上,复方菌草灵芝颗粒3个供试品溶液与菌草灵芝对照药材在硅胶G薄层板上出现耀眼青色斑点,同时观察到阴性对照溶液在同一水平相应位置上无斑点,表明色谱分离效果好,阴性对照品对其鉴定无干扰,专属性强。
图7 复方菌草灵芝颗粒的灵芝薄层色谱鉴别

注:1,菌草灵芝对照药材;2,阴性对照品;3~5,复方菌草灵芝颗粒供试品。网络版为彩图。

Fig.7 TLC identification of Ganoderma lucidum in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

由图8可知,紫外灯下,在同一水平线上,复方菌草灵芝颗粒的3个供试品溶液与紫苏对照药材在硅胶G薄层板上出现红色和黑色斑点,同时观察到不含紫苏的阴性对照品在该位置无红色和黑色斑点,表明色谱分离效果好,专属性强。
图8 复方菌草灵芝颗粒的紫苏薄层色谱鉴别

注:1,紫苏对照药材;2,阴性对照品;3~5,复方菌草灵芝颗粒供试品。网络版为彩图。

Fig.8 TLC identification of Perilla frutescens in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

分别以富硒茶对照药材、EGCG和ECG标准品为对照鉴别颗粒中的富硒茶。由图9可以看出,碘熏后在紫外灯和白炽灯下观察,3个复方菌草灵芝颗粒供试品、富硒茶对照药材、EGCG和ECG标准品在同一水平位置均存在黑色或黄色斑点,而不含富硒茶的阴性对照溶液在该位置无黑色和黄色斑点,色谱分离效果好。
图9 复方菌草灵芝颗粒中富硒茶薄层色谱鉴别

注:图a、b中1为富硒茶对照药材,图c、d中1为EGCG、ECG对照品,2均为阴性对照品,3~5均为复方菌草灵芝颗粒供试品。网络版为彩图。

Fig.9 TLC identification of selenium-riched tea in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

2.3.6 单糖含量测定结果

由图10可知,混合标准品溶液、复方菌草灵芝颗粒供试品溶液中各单糖分别在不同保留时间出峰,混合标准品和颗粒供试品各个单糖的出峰保留时间一致,阴性对照无干扰,色谱分离效果好,专属性强。
图10 单糖HPLC图

注:1,甘露糖;2,鼠李糖;3,葡萄糖;4,半乳糖;5,阿拉伯糖。

Fig.10 HPLC chromatograms of monosaccharides

各单糖的标准曲线方程和相关系数如表5所示。鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准曲线的决定系数分别为0.999 1、0.999 0、0.999 7、0.999 6、0.999 8,都非常接近1,表明标准曲线与样品数据之间相关性很高,测定结果准确可靠。
表5 单糖的标准曲线方程及决定系数

Tab.5 Standard curve equations and correlation coefficients of monosaccharides

单糖 标准曲线方程 决定系数R2 线性范围/(mg·mL-1)
鼠李糖 y1=413 079.436x1-1 014 179 0.999 1 0.1~0.5
甘露糖 y2=319 951x2+733 479 0.999 0 0.1~0.5
葡萄糖 y3=335 249x3+334 898 0.999 7 0.1~0.5
半乳糖 y4=335 249x4+334 898 0.999 6 0.1~0.5
阿拉伯糖 y5=380 601x5+311 412 0.999 8 0.1~0.5
测得5次混合标准品溶液中甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖的峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为1.24%、1.33%、1.37%、1.19%、1.48%,表明方法的精密度良好。根据各单糖标准曲线,以外标法测定5份供试品溶液中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量的RSD分别为1.55%、1.47%、1.26%、1.26%、1.97%,表明方法的重复性良好。测定同一份供试品溶液在0~10 h内的峰面积,每隔2 h测定1次,得到甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖峰面积的RSD分别为1.46%、1.51%、1.19%、0.78%和1.62%,表明供试品溶液室温放置较长时间时其单糖具有良好的稳定性。
单糖加样回收实验结果如表6所示。甘露糖、 葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为99.213%、98.354%、98.306%、96.120%、97.929%,RSD分别为1.28%、1.22%、2.15%、2.35%、1.72%,说明复方菌草灵芝颗粒各单糖的加样平均回收率良好,所建方法简便、可靠、准确,可用于复方菌草灵芝颗粒的质量控制分析。
表6 单糖加样回收实验结果

Tab.6 Results of monosaccharide sample recovery test

单糖 样品含量/(mg·g-1) 加标品量/(mg·g-1) 实测量/(mg·g-1) 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
甘露糖 1.297 1.038 2.328 99.326 99.213 1.28
1.302 1.038 2.327 98.748
1.294 1.556 2.817 97.879
1.301 1.556 2.871 100.900
鼠李糖 1.711 1.368 2.984 93.056 96.120 2.35
1.708 1.368 3.052 98.246
1.717 2.052 3.713 97.271
1.713 2.052 3.681 95.906
葡萄糖 8.710 6.968 15.633 99.354 98.354 1.22
8.705 6.968 15.592 98.838
8.712 10.452 19.019 98.613
8.710 10.452 18.808 96.613
半乳糖 1.265 1.012 2.235 95.850 98.306 2.15
1.269 1.012 2.289 100.791
1.273 1.528 2.786 99.044
1.261 1.528 2.751 97.539
阿拉伯糖 0.815 0.652 1.443 96.319 97.929 1.72
0.818 0.652 1.472 100.307
0.809 0.978 1.764 97.648
0.810 0.978 1.763 97.444
复方菌草灵芝颗粒多糖为杂多糖,由表7可知,其甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均含量分别为1.310、1.166、8.708、1.265、0.824 mg/g,5种单糖物质的量比为1∶0.89∶6.65∶0.97∶0.63。有研究表明灵芝多糖中的甘露糖、葡萄糖含量分别为0.45、0.85 mg/g[37],本研究制备的复方菌草灵芝颗粒中甘露糖、葡萄糖含量分别是上述报道的2.9、10.2倍。
表7 复方菌草灵芝颗粒中单糖含量

Tab.7 Contents of monosaccharides in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

样品 w甘露糖/(mg·g-1) w鼠李糖/(mg·g-1) w葡萄糖/(mg·g-1) w半乳糖/(mg·g-1) w阿拉伯糖/(mg·g-1)
第1批次 1.292 1.170 8.792 1.264 0.812
第2批次 1.311 1.175 8.647 1.249 0.844
第3批次 1.327 1.154 8.684 1.283 0.835
平均 1.310 1.166 8.708 1.265 0.824
RSD/% 1.34 0.94 0.87 1.35 1.41

2.3.7 单酚含量测定结果

由图11可知,单酚混合标准品溶液中EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸分别在不同保留时间出峰,与供试品溶液中的单酚出峰时间一致,分离效果好,专属性强。各单酚的标准曲线方程、决定系数和线性范围如表8所示,标准曲线的线性关系良好。
图11 单酚HPLC图

注:1.没食子酸,2.儿茶素,3.EGCG,4.ECG。

Fig.11 HPLC chromatograms of monophenols

表8 单酚的标准曲线方程及决定系数

Tab.8 Standard curve equations and correlation coefficients of monophenols

单酚 曲线方程 决定系数R2 线性范围/(mg·mL-1)
EGCG y1=12 428 979x1-1 224 884.5 0.999 2 0.10~0.50
ECG y2=15 305 607.5x2-440 143.5 0.999 0 0.04~0.20
儿茶素 y3=6 317 380x3-259 348.4 0.999 4 0.05~0.25
没食子酸 y4=37 301 096.67x4-375 715.3 0.999 4 0.03~0.15
混合标准品中EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸峰面积的RSD分别为1.41%、1.26%、1.32%、1.57%,表明方法的精密度良好。测得的5份供试品溶液中EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸含量的RSD分别为1.84%、1.36%、1.93%、1.12%,表明方法的重复性良好。测定同一份供试品溶液在0~10 h内的单酚峰面积,每隔2 h测定1次,得到EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸峰面积的RSD分别为1.46%、1.91%、1.62%、1.59%,表明供试品溶液室温放置较长时间时其单酚具有良好稳定性。单酚加样回收实验结果如表9所示。EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸的平均回收率分别为98.188%、96.988%、98.955%、97.885%,各单酚的回收率良好,说明所建方法准确可靠。
表9 单酚加样回收实验结果

Tab.9 Results of monophenol sample recovery test

单酚 样品质量分数/(mg·g-1) 加标品量/(mg·g-1) 实测量/(mg·g-1) 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
EGCG 5.821 4.632 10.327 97.280 98.188 1.23
5.792 4.632 10.303 97.388
5.824 6.948 12.646 98.187
5.813 6.948 12.754 99.899
ECG 2.613 2.064 4.602 96.366 96.988 2.33
2.594 2.064 4.631 98.692
2.599 3.096 5.511 94.057
2.586 3.096 5.646 98.837
儿茶素 1.705 1.376 3.086 100.363 98.955 1.06
1.712 1.376 3.071 98.750
1.697 2.064 3.716 97.820
1.708 2.064 3.749 98.886
没食子酸 1.694 1.336 2.974 95.808 97.885 1.57
1.682 1.336 2.987 97.680
1.687 2.004 3.670 98.952
1.707 2.004 3.693 99.102
由表10可知,复方菌草灵芝颗粒中EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸的平均含量分别为5.79、2.58、1.72、1.67 mg/g,4种单酚物质的量比为3.47∶1.54∶1.03∶1。有研究表明乌龙茶中EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸的含量分别为 5.38、1.09、0.06、0.06 mg/g[38],本研究中复方菌草灵芝颗粒的EGCG、ECG、儿茶素、没食子酸含量分别是该研究中茶叶的1.1、2.4、28.7、27.8倍,其中儿茶素和没食子酸含量尤为突出。
表10 复方菌草灵芝颗粒中单酚含量

Tab.10 Contents of monophenols in compound Juncao Ganoderma lucidum granules

样品 wEGCG/(mg·g-1) wECG/(mg·g-1) w儿茶素/(mg·g-1) w没食子酸/(mg·g-1)
第1批次 5.84 2.60 1.69 1.69
第2批次 5.82 2.54 1.72 1.65
第3批次 5.71 2.59 1.74 1.68
平均 5.79 2.58 1.72 1.67
RSD/% 1.21 1.32 1.42 1.39

3 讨论

复方菌草灵芝颗粒以菌草灵芝、富硒茶和紫苏为主药,甘露醇为辅料,通过湿法制粒而成。本课题组前期已对复方菌草灵芝颗粒的制备工艺和药效学进行了初步探究,但尚未对复方菌草灵芝颗粒的提取工艺进行优化,也未建立质量标准对该复方颗粒进行质量控制。本文通过超声辅助水提的方法探究浸泡时间、提取温度、超声时间、料液比和提取次数对复方菌草灵芝颗粒浸膏得率和多糖含量的影响,得到复方菌草灵芝颗粒的最佳水提工艺为超声温度80 ℃、超声时间2.5 h、料液比(g/mL)1∶25、提取次数2次、浸泡时间6 h。温度对浸膏得率和多糖含量的影响很显著,提取温度在50~80 ℃范围内时,随着温度的升高,分子运动加快,多糖易于在水中溶出,浸膏得率和多糖含量快速增加。当提取温度高于80 ℃时多糖提取率反而降低,这一方面可能是因为温度过高使得多糖降解[39],另一方面其他物质溶出增加了溶液黏稠度,阻碍了多糖溶出[40]。随着超声时间的延长多糖提取率逐渐升高,但超声时间超过2.5 h后多糖提取率急速下降,其原因可能有以下几个方面:1)随着提取时间的增加多糖浓度梯度减小,溶出率减缓[41];2)提取时间过长可能会导致多糖水解和溶剂挥发,使多糖得率下降[42];3)超声的强剪切作用使得多糖糖苷键断裂[43],造成多糖损失。当料液比(g/mL)在1∶10~1∶25范围内时,随着料液比的增大浸膏得率和多糖含量逐渐增加。超声波在液相中的吸收大于在固相中的吸收,随着溶剂量的增大,细胞内部的多糖等物质向外扩散,浸膏得率和多糖含量也随之增大[31]。根据响应面实验结果,实测值接近且高于预测值,表明优化得到的复方菌草灵芝颗粒水提工艺条件稳定、可靠,所得制剂中多糖含量最高,保证了产品的药理活性和功效。
质量是药品制剂安全有效的重要保证,对制定制剂的质量标准一般要求是:选择主要有效成分或指标成分进行检识,检测方法专属性强、快速、简便、重现性好[44-45]。菌草灵芝、紫苏和富硒茶主要含有多糖、茶多酚、黄酮等活性成分。部分黄酮化合物母体结构为交叉共轭体系,平面性强,分子间排列紧密,溶剂分子不易进入,在多数溶剂中溶解度较小[46]。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一,与灵芝的多种药理活性有关,是一类重要的生物反应调节剂,真菌多糖的生物活性与多糖结构存在重要构效关系[47]。本研究中提取工艺为超声波辅助水提,多糖和茶多酚溶解性较好,部分黄酮及其他醇类、脂类溶解性较差,因此选择多糖和茶多酚作为检测指标。
本研究中复方菌草灵芝颗粒的粒度、水分含量、干燥失重、装量差异、可溶性、微生物限量和重金属含量均符合2015版《中国药典》和国标的要求;其硒质量分数为0.058 mg/kg,可考虑作为硒补充剂。薄层色谱和高效液相色谱具有专属性强、易操作等特点,为复方制剂定性鉴别的主要手段。本研究利用薄层色谱法鉴别出复方菌草灵芝颗粒中菌草灵芝、紫苏和富硒茶,得到的色谱图斑点清晰、专属性强、分离效果好,阴性对照对其无干扰,方法简单可靠。利用高效液相色谱法测定复方菌草灵芝颗粒中单糖和单酚的含量,发现颗粒中单糖和单酚含量丰富;方法可行性考察结果表明所建立的测定方法科学可靠。综上,本研究优化得到的复方菌草灵芝颗粒水提工艺稳定可靠,颗粒的各项指标均符合要求,为复方菌草灵芝颗粒质量控制提供了保障。

4 结论

通过单因素和响应面实验考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数和浸泡时间对复方菌草灵芝颗粒浸膏得率和浸膏多糖含量的影响,得到的最佳水提工艺为超声温度80 ℃、超声时间2.5 h、料液比(g/mL)1∶25,提取次数2次,浸泡时间6 h。优化得到的复方菌草灵芝颗粒水提工艺稳定可靠,建立的水提工艺质量标准科学可行,确保了最佳工艺产品中多糖含量高且结构完整,产品的药理活性和功效最佳。采用薄层色谱法鉴别复方菌草灵芝颗粒中菌草灵芝、紫苏和富硒茶的方法效果显著,简单可靠;所建立的HPLC测定复方菌草灵芝颗粒中单糖和单酚含量的方法科学可靠,为复方菌草灵芝颗粒质量控制提供了保障。

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