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2024 , Vol. 52 >Issue 5: 82 - 96

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024227

Protective effects of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. on alcoholic liver injury

  • ZHOU Lanqi ,
  • LIU Tianqi ,
  • LYU Jiayao ,
  • ZHANG Xumeng ,
  • WANG Peng ,
  • SHI Lin , *
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  • School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, Shaanxi, China

Received date: 2023-11-17

  Online published: 2024-09-27

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Abstract

Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. (PK), a well-known Food and Medicine homology in China, riches in various bioactive ingredients and has been consumed for thousands of years with a wide range of applications. PK has shown great tonic effects. Previous studies have consistently shown nutritional functions of PK including liver protection. The Nine Steaming Nine Drying is a traditional processing technique that has been considered as an effective method in enriching tonic properties, but its impacts on improving efficacy of PK on liver protection remain largely unexplored. This study herein applied integrative analysis of metabolomics and bioinformatics, as well as molecular docking, to reveal the core bioactive compounds responsible for the improved effects of Nine Steaming Nine Drying processed PK extracts (PPK) on the prevention and treatment of alcoholic liver injury and its underlying mechanisms.Through constructing an alcohol induced injury model using LO2 cells, the regulatory effects of PPK on cell activity, oxidative stress, and alcohol metabolism enzymes (ethanol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase) were investigated. A total of 204 metabolites in the PPK were compared with crude PK extracts (CPK). Alcohol induced liver injury related targets were obtained by searching for DisGeNET, TTD, GeneCard, and OMIM databases, and a compound-target network was established. Results from protein-protein interaction networks and enrichment analysis identified 23 functional metabolites (including rutin, furanone, caffeic acid, gallic acid, etc.) that may be responsible for the protective effects of PPK on alcoholic liver injury via regulating 15 action targets involved in PI3K-Akt, AMPK, NF- kB signaling pathways. High affinity between the identified key constituents of PPK and their predicted acting targets was confirmed using molecular docking. Results indicate that PPK can alleviate alcoholic liver injury by regulating oxidative stress, inflammation, and ethanol metabolisms. It provides novel insights in nutritional functions of PPK, and an effective strategy for systematically elucidating the mechanisms of functional foods.

Key words： Food and Medicine homology; Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.; alcohol induced injury of LO2 cells; metabolomics; bioinformation database; molecular docking

Cite this article

ZHOU Lanqi , LIU Tianqi , LYU Jiayao , ZHANG Xumeng , WANG Peng , SHI Lin . Protective effects of Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. on alcoholic liver injury[J]. Journal of Shaanxi Normal University(Natural Science Edition), 2024 , 52(5) : 82 -96 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024227

酒精性肝损伤(alcoholic liver disease,ALD)是饮酒的常见临床并发症,其发病机制复杂,由多种因素共同介导,其中与酒精代谢相关的氧化应激和炎症是ALD的主要发病诱因[1]。肝脏是酒精代谢的主要场所,乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)在酒精代谢过程中起着关键作用[2],过量饮酒会导致ADH、ALDH及体内氧化环境失衡,产生肝毒性并引发氧化应激和炎症[3]。酒精性肝病的临床治疗主要采取戒酒、营养支持和药物干预等综合疗法,研发拮抗酒精性肝损伤的食源性、天然低毒副作用、多途径的肝脏保护剂,是目前药学和食品科学领域共同关注的研究热点[4-5]。
滇黄精(Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl., PK)是我国著名的食药两用食物,主产于云南,享有“气血双补之王”的美誉,最早记载于《名医别录》[6],具有抗炎、抗氧化、护肝等生理活性[7]。因新鲜的滇黄精具有麻舌感,历代本草多提倡食用炮制品[8]。几千年来,九蒸九制是滇黄精历史最悠久、使用最广泛的炮制方法[9]。《本草纲目》曾记载:“九蒸九曝,可以代粮,可以米辅”,九蒸九制炮制方法因其去涩提味、滋补增效之益在众多传统炮制方法中脱颖而出[10-11]。近期研究发现,PK可以降低肝脏中性粒细胞浸润标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性和炎性细胞因子的水平[12]。然而,鲜有关注PK拮抗ALD的活性研究,九蒸九制的物质富集体系是否有助于缓解ALD,其功效机制为何,尚无报道。
代谢组学是系统生物学的重要组成部分,可通过对代谢成分定性定量分析定义生物体的生化表征及与营养功能的关系[13]。代谢组学的常见分析方法包括液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法和核磁共振等[14]。超高液相色谱-质谱联用相较传统色谱方法,灵敏度、色谱峰容量及分析通量均得到大幅提升,如今在食药两用植物作用功效及机理研究方面已得到广泛应用[15]。此外,如何系统性预测营养功能、鉴定核心功效物质基础一直是食药同源研究的技术瓶颈。基于系统生物学和计算机技术发展起来的系统生物信息学,可将研究对象作为一个完整的系统,通过各种生物信息学数据库提取相关信息,构建“活性成分-靶点-疾病”网络,进而挖掘定向作用于疾病靶点的核心成分及关键通路,为食药同源资源复配产品提供新思路[16]。目前,高通量代谢组学和生物信息数据库的协同作用模式在探究中药的健康促进作用方面得到广泛应用[15,17]。
本研究通过构建酒精损伤LO2肝细胞模型,研究九蒸九制滇黄精水提物在改善酒精损伤细胞活性及氧化应激相关指标方面的有益作用。采用高通量代谢组学结合生物信息数据库分析的方法,探究九蒸九制滇黄精水提物对ALD的治疗作用及分子机制,创新性地基于药代动力学和分子对接虚拟筛选验证其作用于ALD的核心成分及作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜滇黄精,由云南省普洱市院士专家工作站专家鉴定为滇黄精(Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.)干燥根茎,并提供原材料。
甲醇、乙腈,色谱纯,Merck;标准品,色谱纯,BioBioPha/Sigma-Aldrich。所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。
LO2细胞(人正常肝细胞),武汉普诺赛生命科技有限公司;噻唑兰(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT),上海生工生物技术有限公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、高效RIPA蛋白裂解液,上海源叶生物有限公司;丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪,美国Supelco公司;Nexera X2超高效液相色谱仪,日本SHIMADZU公司;Applied Biosystem 4500 QTRAP串联质谱仪,Thermo Fisher Scientific-CN公司;立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TripleTOF 6600质谱仪,美国SCIEX公司;267976N-1300型旋转蒸发仪、LGJ-18C真空冷冻干燥机,上海埃朗科技国际贸易有限公司;K6600全波长酶标仪,北京凯奥科技发展有限公司。

1.3 样品制备

取新鲜滇黄精,去杂、洗净、切片,清蒸1 h,60℃下烘干至恒重,重复操作9次,得到九蒸九制滇黄精[18]。参考文献[19]的方法制备新鲜滇黄精水提物(crude Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. extracts,CPK)和九蒸九制滇黄精水提物(Nine Steaming Nine Drying processed Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. extracts,PPK),冻于-20 ℃备用。

1.4 细胞实验方法

采用MTT法[20]从2%、3%、4%、5%、6%、7%乙醇中筛选乙醇损伤肝细胞的最佳浓度。参考文献[20]的方法培养LO2细胞,通过细胞存活率表征不同质量浓度的滇黄精水提物(PPK:0.1、0.3、0.5、1、3、5 mg/mL,CPK:0.1、0.5、1、3 mg/mL)对LO2细胞的毒性效应。通过测定细胞液中CAT、SOD、GSH、MDA、AST、ALT、ADH、ALDH的含量,探究滇黄精水提物对酒精诱导损伤LO2肝脏细胞的保护作用。

1.5 UPLC-MS/MS代谢组学分析

分别准确称取100 mg CPK和100 mg PPK,完全溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中,漩涡6次,每次30 s,于4 ℃冰箱过夜,离心10 min后取上清,用微孔滤膜过滤后保存于进样瓶中。样品采用超高效液相色谱系统HILIC色谱柱进行分离,柱温40 ℃,流速为0.35 mL/min,流动相组成为A(超纯水+0.1%甲酸)和B(乙腈+0.1%甲酸),整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响,采用随机顺序进行样本的连续分析,并在检测队列中插入质控样品监测,评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。分别采用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经超高效液相色谱仪分离后用质谱仪进行质谱分析,ESI源条件如下:离子源气体1(Gas1)为50 psi,离子源气体2(Gas2)为60 psi,气帘气为25 psi,源温度为550 ℃,电压浮动(ionspray voltage floating,ISVF)±5 500 V(正负离子模式)。

1.6 化学成分筛选、潜在靶点基因和核心化合物信息提取

在UPLC-MS/MS检测出来的代谢物中筛选出只在PPK中出现的且处理后显著富集的代谢物(倍率变化大于5,FDR-P<0.05)。使用中药系统药理学数据库(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch)获取富集化合物的基因靶点,得到的蛋白靶点使用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)转化成基因靶点以便后续分析。以“alcohol toxicity”“alcohol poisoning”“alcoholism”“alcoholic fatty liver”为关键词,通过DisGeNET、TTD、GeneCard、OMIM数据库获取酒精性肝损伤相关靶点,合并去重获取最终疾病靶点。使用R(V4.2.2)软件取PPK和酒精性肝损伤的交集靶点并绘制韦恩图,得到滇黄精-化合物-酒精性肝损伤共同靶点。基于String数据库(https://cn.string-db.org)进行蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析。将共同靶点导入数据库获取蛋白互作关系,使用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化分析,利用cytoHubba插件获取核心基因hub genes,提取与这20个核心基因具有强关联的化合物。使用SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch)分析化合物的药代动力学参数,评估核心化合物在体内的吸收代谢情况。

1.7 靶点基因通路分析及网络关系构建

采用Metascape数据库(https://metascape.org)对食物-疾病共同靶点进行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,得到PPK作用于酒精性肝损伤的核心通路。采用Cytoscape 3.9.1绘制滇黄精-化合物-靶点网络,采用Network analysis对网络特征指标度(degree)进行分析,解析PPK保护酒精性肝损伤的营养功效机制。

1.8 分子对接

采用Autodock Vina软件对核心化合物与乙醇脱氢酶(ADH,PDB ID:3COS、1AGN、1HSO、1HTO)、乙醛脱氢酶(ALDH,PDB ID:4WJ9、8BB8、7MJC、4QGK)进行分子盲对接,获取对接结合能;使用R(V4.2.2)软件绘制分子对接热图,使用Pymol软件对对接结果进行可视化分析。

1.9 数据分析

实验所有数据测定3次平行,使用R(V4.2.2)软件进行计算,连续变量以平均值±标准差进行表示,组间差异分析通过非参数Wilcoxon进行检验。

2 结果与分析

2.1 PPK对酒精诱导损伤LO2细胞的保护效应

参考文献[20]方法,经终质量分数为2%~7%的乙醇培养基作用4 h后,LO2细胞的活力均显著低于对照组,且随着乙醇质量分数的增加,细胞活力逐渐降低(图1a)。本研究使用6%乙醇诱导肝细胞,以保证实验后期的细胞数量足够。图1b为不同质量浓度滇黄精水提物对LO2细胞活力的影响,与对照组相比,滇黄精水提物在1 mg/mL质量浓度及以下时对细胞无毒性作用。
图1 不同质量浓度PPK和CPK对酒精诱导损伤LO2细胞的保护效应

注:*表示与6%酒精组相比差异显著(P<0.05), **表示与6%酒精组相比差异极显著(P<0.01)。

Fig.1 Protective effects of PPK and CPK at different concentrations on alcohol induced injury to LO2 cells

可以看出,PPK通过提升LO2细胞液中CAT(P<0.01,图1c)、GSH(P<0.01,图1d)、SOD(P<0.05,图1e)的水平显著改善LO2细胞的氧化应激水平。相同质量浓度下PPK的提升效果优于CPK;当质量浓度为1 mg/mL时,在GSH(P<0.01)和SOD(P<0.05)水平上表现更为显著。此外,1 mg/mL PPK通过显著提升ADH(P<0.01,图1f)和ALDH(P<0.05,图1g)水平,降低MDA(P<0.05,图1h)、AST(P<0.01,图1i)和ALT(P<0.01,图1j)水平改善酒精对LO2肝细胞的损伤程度。相比于同质量浓度的CPK,PPK对ALDH、MDA和ALT的改善效果更为显著。
以往研究表明,CAT、SOD和GSH水平与自由基清除能力正相关[21],可综合评价不同质量浓度滇黄精水提物对酒精诱导LO2细胞的氧化应激水平。ADH和ALDH是酒精代谢的关键蛋白[2],已被确定为人体组织中肝细胞坏死的特异性指标。MDA作为脂质过氧化的主要终产物之一,联同AST和ALT共同作为评估肝细胞脂质过氧化和细胞损伤程度的敏感指标[20,22]。以上结果表明,滇黄精水提物可以通过改善氧化应激水平和肝损伤程度起到对LO2细胞的保护效应,且在相同质量浓度下,PPK的保护效果优于CPK,其中,1 mg/mL被视为最优质量浓度,兼具无毒性作用及保护效应。需注意的是,当PPK质量浓度提至3 mg/mL后,对细胞活性有负面影响(P<0.05),这可能是因为滇黄精水提物中富含黄酮类化合物。已有研究表明,高剂量黄酮具有一定的诱变性和潜在毒性,它一方面作为强氧化剂产生游离的自由基损坏DNA,另一方面通过几何嵌入结合在DNA上,作为DNA嵌入剂影响DNA的正常转录、复制,进而导致细胞毒性、基因毒性[23]。

2.2 PPK代谢组分析、核心靶点预测及活性成分筛选

经超高效液相串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-MS/MS)共鉴定出551种滇黄精经九蒸九制炮制富集的代谢物,包括17%酚酸类(92种)、13%脂质(74种)、13%类黄酮(73种)、11%氨基酸及其衍生物(61种)、11%有机酸(60种)、11%生物碱(58种)、5%木脂素和香豆素(28种)、5%核苷酸及其衍生物(26种)、2%萜类(9种)及其他(图2a)。通过差异分析发现,CPK和PPK的代谢物存在显著差异,尤其体现在呋喃酮(furoaloesone)、白杨素(chrysin)、丁香酸(syringic acid)、柚皮苷(naringin)等物质上(图2b)。
图2 PPK和CPK UPLC-MS/MS检测代谢物分析

注:网络版为彩图;M为差异倍数。

Fig.2 The metabolite analysis of PPK and CPK identified by UPLC-MS/MS

九蒸九制显著改变了滇黄精代谢组。相比于CPK,PPK显著富集204种化合物(倍率变化大于5,FDR-P<0.05),包括原儿茶酸(protocatechuic acid,分子质量154.027 Da,离子碎片153.02/109.03)、丁香酸(syringic acid,分子质量198.053 Da,离子碎片197.05/123)、阿魏酸(ferulic acid,分子质量194.058 Da,离子碎片193.05/134.01)、呋喃酮(furoaloesone,分子质量256.074 Da,离子碎片257.08/239.07)、槲皮素(quercetin,分子质量302.043 Da,离子碎片303.05/137.02)、隐绿原酸(cryptochlorogenic acid,分子质量354.095 Da,离子碎片353.09/191.05)、咖啡酸(caffeic acid,分子质量180.042 Da,离子碎片179.03/135.05)等酚酸类化合物及L-苏氨酸(L-threonine,分子质量119.058 Da,离子碎片120.07/74)等氨基酸类化合物。已有研究表明,这些显著富集的酚酸类和氨基酸类化合物可以有效提升滇黄精保肝、促消化等健康功效[24-25]。咖啡酸和绿原酸通过改变小鼠的短链脂肪酸含量和微生物群维持肠肝轴稳态,对酒精性脂肪肝病起到预防作用[24,26];槲皮素通过激活PI3K-Akt信号通路抑制肝细胞凋亡[27]。此外,大量研究表明滇黄精多糖作为主要活性成分,具有抗氧化应激、抗炎等多种功效[28⇓-30];课题组前期研究发现九蒸九制炮制可提升滇黄精多糖含量,但并不影响其单糖组成[10,31]。
基于生物信息数据库检索,共获取718个与富集代谢物相关的基因靶点和8 583个与酒精性肝损伤相关的基因靶点,取两者交集,获得潜在靶点617个(图3)。这些潜在靶点共涉及52种代谢物,或为PPK保护酒精性肝损伤的重要活性成分(表1)。
图3 PPK靶点和酒精性肝损伤靶点韦恩图

Fig.3 Wayne diagram of PPK targets and alcoholic liver disease (ALD) targets

表1 PPK活性成分信息

Tab.1 Information on active components of PPK

编号 化合物名称 分子式 分子质
量/Da		 代谢物
鉴定分级		 电离模式 关联交集
靶点个数
PPK1 呋喃酮
(furoaloesone)		 C15H12O4 256.074 1 2 [M+H]+ 82
PPK2 对香豆酰酒石酸
(coutaric acid)		 C13H12O8 296.053 2 1 [M-H]- 62
PPK3 2(R)-羟基-3-丁烯基硫苷
(2(R)-hydroxy-3-butenyl glucosinolate)		 C11H19NO10S2 389.045 1 3 [M-H]- 60
PPK4 7-羟基-β-咔啉-1-丙酸
(7-hydroxy-β-carboline-1-propionic acid)		 C14H12N2O3 256.301 0 3 [M+H]+ 55
PPK5 N-阿魏酰胍丁胺
(N-feruloylagmatine)		 C15H22N4O3 306.169 1 2 [M+H]+ 46
PPK6 芥子酰腐胺
(sinapoylputrescine)		 C15H22N2O4 294.158 2 1 [M+H]+ 45
PPK7 3-羟基丙酸
(3-hydroxypropanoic acid)		 C3H6O3 90.032 4 1 [M-H]- 27
PPK8 芦丁(rutin) C27H30O16 610.153 9 1 [M-H]- 27
PPK9 环(脯氨酸-缬氨酸)
(cyclo (Pro-Val) )		 C10H16N2O2 196.122 1 2 [M+H]+ 23
PPK10 咖啡酸
(caffeic acid)		 C9H8O4 180.042 5 1 [M-H]- 21
PPK11 6-苄基氨基嘌呤
(6-benzylaminopurine)		 C12H11N5 225.101 2 3 [M-H]- 17
PPK12 鸢尾黄素
(tectorigenin)		 C16H12O6 300.063 0 1 [M-H]- 14
PPK13 隐绿原酸
(cryptochlorogenic acid)		 C16H18O9 354.095 1 1 [M-H]- 11
PPK14 对苯二甲酸
(terephthalic acid)		 C8H6O4 166.027 3 1 [M-H]- 11
PPK15 延胡索酸
(fumaric acid)		 C4H4O4 116.011 4 1 [M-H]- 10
PPK16 1-甲氧基吲哚-3-甲醛
(1-methoxyindole-3-carbaldehyde)		 C10H9NO2 175.063 2 2 [M-H]+ 8
PPK17 2-吡啶甲酸
(2-picolinic acid)		 C6H5NO2 123.032 2 2 [M-H]- 7
PPK18 3-羟基扁桃酸
(3-hydroxymandelate)		 C8H8O4 168.042 8 3 [M-H]- 6
PPK19 3,4-二羟基-L-苯丙氨酸
(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)		 C9H11NO4 197.069 7 3 [M+H]+ 5
PPK20 白杨素
(chrysin)		 C15H10O4 254.058 0 3 [M+H]+ 4
PPK21 秦皮素
(fraxetin)		 C10H8O5 208.037 6 2 [M+H]+ 4
PPK22 没食子儿茶素
(gallocatechin)		 C15H14O7 306.074 3 1 [M+H]+ 4
PPK23 王百合苷C
(regaloside C)		 C18H24O11 416.132 5 3 [M-H]- 4
PPK24 3-(3-羟基苯基)丙酸
(3-(3-hydroxyphenyl)-propionic acid)		 C9H10O3 166.063 8 3 [M-H]- 3
PPK25 原儿茶酸
(protocatechuic acid)		 C7H6O4 154.027 3 2 [M-H]- 3
PPK26 环(脯氨酸-苯丙氨酸)
(cyclo (Pro-Phe) )		 C14H16N2O2 245.128 9 3 [M+H]+ 3
PPK27 香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖
(diosmetin-7-O-β-D-glucopyranoside)		 C22H22O11 462.116 2 2 [M+H]+ 3
PPK28 槲皮苷
(quercitrin)		 C21H20O11 448.101 8 2 [M+H]+ 3
PPK29 6,7-二羟基-4-甲基香豆素
(6,7-dihydroxy-4-methylcoumarin)		 C10H8O4 192.042 4 3 [M+H]+ 2
PPK30 对乙酰氨基酚
(acetaminophen)		 C8H9NO2 151.063 2 3 [M-H]- 2
PPK31 邻苯二酚
(pyrocatechol)		 C6H6O2 110.037 4 1 [M-H]- 2
PPK32 3,5,7,4'-四羟基-8-甲氧基黄酮
(sexangularetin)		 C16H12O7 316.058 7 2 [M-H]- 2
PPK33 伞形酮
(umbelliferone)		 C9H6O3 162.032 3 2 [M-H]- 2
PPK34 香草酸
(vanillic acid)		 C8H8O4 168.042 7 1 [M-H]- 2
PPK35 3-(2-(甲基氨基)乙基)-1H-吲哚-5-醇
(3-(2- (methylamino) ethyl) -1H-indol-5-ol)		 C11H14N2O 190.111 4 3 [M+H]+ 1
PPK36 3-羟基-5,7,8-三甲氧基黄酮
(3-hydroxy-5,7,8-trimethoxyflavone)		 C18H16O6 328.095 6 3 [M+H]+ 1
PPK37 3,4-二甲氧基肉桂酸
(3,4-dimethoxycinnamic acid)		 C11H12O4 208.212 0 2 [M+H]+ 1
PPK38 4-羟基-2-酮戊二酸
(4-hydroxy-2-oxoglutaric acid)		 C5H6O6 162.016 0 3 [M-H]- 1
PPK39 4-氧代戊酸
(4-oxopentanoic acid)		 C5H8O3 116.047 8 3 [M-H]- 1
PPK40 环(酪氨酸-亮氨酸)
(cyclo (Tyr-Leu) )		 C15H20N2O2 260.152 0 2 [M+H]+ 1
PPK41 D-赤藓糖-4-磷酸
(D-erythrose-4-phosphate)		 C4H9O7P 200.009 8 3 [M-H]- 1
PPK42 DL-2-氨基己二酸
(DL-2-aminoadipic acid)		 C6H11NO4 161.069 9 2 [M+H]+ 1
PPK43 高车前素-7-O-葡萄糖苷
(hispidulin-7-O-glucoside)		 C22H22O11 462.118 6 2 [M+H]+ 1
PPK44 高香草酸
(homovanillic acid)		 C9H10O4 182.058 2 3 [M-H]- 1
PPK45 异莨菪亭
(isoscopoletin)		 C10H8O4 192.042 8 3 [M+H]+ 1
PPK46 糠酸甲酯
(methyl 2-furoate)		 C6H6O3 126.115 2 3 [M-H]- 1
PPK47 N-乙酰神经氨酸
(N-acetylneuraminic acid)		 C11H19NO9 309.106 5 3 [M-H]- 1
PPK48 球松素查尔酮
(pinostrobin chalcone)		 C16H14O4 270.089 6 3 [M+H]+ 1
PPK49 黄精素A
(polygonatine A)		 C9H11NO2 165.069 3 1 [M+H]+ 1
PPK50 滇黄芩新苷
(scuteamoenoside)		 C22H24O11 464.132 5 3 [M+H]+ 1
PPK51 芥子酸
(sinapic acid)		 C11H12O5 224.068 2 1 [M-H]- 1
PPK52 十三烷酰甘氨酸
(tridecanoylglycine)		 C15H29NO3 271.215 9 3 [M+H]+ 1

2.3 滇黄精-化合物-靶点网络的构建与分析

PPK作用于酒精性肝损伤的PPI网络图如图4所示,关键靶点包括VEGFA、STAT3、JUN、HIF1A等,主要涉及氧化应激和抗炎通路[1]。肝脏血管生成是肝脏发生炎症和纤维化的关键阶段,肝巨噬细胞可以通过刺激VEGFA、HIF-1A和TNF的表达刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)进而诱导心血管形成[3,28]。JAK2/STAT3信号通路在模型小鼠内质网应激和细胞凋亡方面的重要作用已经在肝缺血再灌注损伤模型小鼠中得到验证[32]。
图4 PPK解酒保肝蛋白相互作用网络图和前20个核心靶点网络图

注:网络版为彩图。

Fig.4 PPI network diagram and the top 20 hub genes network diagram of PPK in the treatment of alcoholic liver disease

网络拓扑分析筛选可得PPK中发挥功效的12个重要化合物(表2),其中,关联度最高的化合物是芥子酰腐胺(sinapoylputrescine)、芦丁(rutin)、咖啡酸(caffeic acid)和秦皮素(fraxetin)。芥子酰腐胺通过抑制甘氨酸的裂解抵抗大鼠应激性肝损伤[33];芦丁可能通过抑制脂质过氧化损伤减轻小鼠酒精性肝损伤[34];咖啡酸通过减少肝脏炎症和氧化应激改善酒精性肝病小鼠的肝功能和肝组织病变程度[26];秦皮素可以通过激活ROS清除基因抑制ROS的产生,进而减少机体炎症和氧化应激[35]。
表2 关键靶点和化合物的关联信息

Tab.2 Association information for the top 20 hub genes and compounds

靶点 节点连线数 ID 化合物名称
VEGFA 178 P15692 4-羟基-14-酮戊二酸
STAT3 174 P40763 2(R)-羟基-3-丁烯基硫苷
JUN 185 P05412
HIF1A 150 Q16665
MTOR 149 P42345 芥子酰腐胺
HRAS 162 P01112
MAPK8 87 P45983
IL6 211 P05231 芦丁
MAPK3 179 P27361
AKT1 260 P31749
TNF 229 P01375 咖啡酸
PTGS2 126 P35354
CASP3 174 P42574 秦皮素
CASP8 87 Q14790
SRC 185 P12931 延胡索酸
CCND1 136 P24385 N-阿魏酰胍丁胺
EGFR 188 P00533 顺式-对香豆酰酒石酸
MMP9 131 P14780 没食子儿茶素
HSP90AA1 176 P07900 7-羟基-β-咔啉-1-丙酸
IL1B 182 P01584 鸢尾黄素

2.4 潜在靶点富集分析及活性成分-作用靶点-核心通路网络构建

为阐明PPK发挥解酒保肝功效的作用机制,进一步对滇黄精九蒸九制富集的重要化合物潜在靶点进行富集分析。GO富集得到4 006个结果,其中生物过程(GO-BP)3 276个,细胞组成(GO-CC)215个,分子功能(GO-MF)515个,分别选取排名前15的GO-BP、GO-CC、GO-MF绘制富集圈图(图5a)。
图5 GO功能注释分析和关键KEGG通路富集分析

注:网络版为彩图。

Fig.5 GO function annotation analysis and enrichment analysis of key KEGG pathways

KEGG富集分析得到252条相关通路,以基因比例、-lg q及富集到调控通路上的基因个数来衡量KEGG通路富集程度,取排名前20的条目作气泡图(图5b)。其中,颜色越红,气泡越大,说明潜在靶点在该条通路的富集程度越高,越有可能作为PPK发挥保肝功效的核心通路。结果表明,核心通路主要涉及cAMP、PI3K-Akt、AMPK、VEGF、NF-κB等与氧化应激和炎症紧密关联的信号通路。
利用上述分析所得的52个重要活性成分、617个潜在靶点以及排名靠前的20条富集通路构建活性成分-作用靶点-核心通路网络,展示活性成分、潜在靶点和富集通路之间的关系(图6)。通过网络拓扑分析可以发现degree≥10的化合物高达15个,其中,呋喃酮(furoaloesone)、顺式-对香豆酰酒石酸(Cis-coutaric acid)、N-阿魏酰胍丁胺(N-feruloylagmatine)、芥子酰腐胺(sinapoylputrescine)、芦丁(rutin)、咖啡酸(caffeic acid)均表现出较高的degree值;呋喃酮(furoaloesone)的关联度最高(degree=82),顺式-对香豆酰酒石酸(Cis-coutaric acid)次之(degree=62)。这些化合物大都具有较好的抗炎、抗氧化能力,或可直接或间接地作用于酒精性肝损伤[26,30⇓-32]。
图6 靶向疾病-活性成分-作用靶点-核心通路网络图

注:网络版为彩图。

Fig.6 Targeted disease-active constituents-hub targets-key pathways network diagram

在活性成分-作用靶点-核心通路网络中,共有13个基因靶点的degree≥10,呈现出高关联度,包括AKT1、PIK3R1、PIK3CD、PIK3CB、PIK3CA、PRKACA、MAPK3、MAPK1、PRKCB、PRKCA、MAP2K1、PRKCG和ADCY1。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,由催化亚基和调节亚基组成,PIK3R1属于调节亚基,PIK3CD、PIK3CB和PIK3CA属于催化亚基,它们均在PI3K-AKT信号通路中起着至关重要的作用[36];MAPK3、MAPK1和MAP2K1属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),在MAPK级联激活(MAP3K-MAP2K-MAPK)中发挥重要作用,共同参与MAPK信号通路介导氧化应激、炎症,减轻乙醇堆积对肝脏的损伤[37]。信号通路中degree较高的分别是PI3K-Akt 信号通路(hsa04151)、钙信号途径(hsa04020)、cAMP信号通路(hsa04024)、细胞凋亡(hsa04210),它们可能是PPK发挥解酒保肝作用的重要通路,与KEGG富集分析结果吻合。
综上,PPK主要通过呋喃酮(furoaloesone)、N-阿魏酰胍丁胺(N-feruloylagmatine)、芦丁(rutin)、咖啡酸(caffeic acid)等活性成分介导PI3K-Akt、cAMP、AMPK等关键信号通路,调控体内氧化应激和炎症反应,缓解肝脏损伤,解酒保肝。

2.5 核心功效化合物药代动力学预测

取活性成分-作用靶点-核心通路网络中degree值排名前20的化合物联合PPI网络中关键靶点所涉及的12个化合物(共23个核心化合物),共同作为PPK解酒保肝的核心化合物,基于SwissADME数据库分析核心化合物的药代动力学。舍去未检索到药代动力学信息的化合物,其余核心化合物的药代动力学参数见表3。SwissADME数据库通过分子结构预测吸收、分布、代谢和排泄等ADME参数,为药食两用资源研发及临床应用提供参考[38]。化合物的物理化学特性、亲油性、水溶性及化合物动力学是分析药代动力学参数主要考虑的几个方面。无论是口服还是用于胃肠道之外的化合物,溶解度都是影响吸收的主要特性,具有可溶性的分子更有利于配制与吸收[39]。本研究中,除3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoic acid)外,其余化合物的水溶性药代动力学参数lg S≤0.25,说明它们具有良好的水溶性。除2(R)-羟基-3-丁烯基硫苷(2(R)-hydroxy-3-butenyl glucosinolate)和3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoic acid)外,其余化合物的脂溶性药代动力学参数(XLOGP3)均介于-0.7~5,表明化合物具有良好的脂溶性。
表3 PPK核心化合物药代动力学预测

Tab.3 Pharmacokinetic prediction of core constituents in PPK

编号 核心化合物 节点连线数 HBA/HBD BO 脂水系数 GI BBB Pgp
PPK1 呋喃酮 82 4/0 0.55 2.46 高 是 否
PPK2 顺式-对香豆酰酒石酸 62 8/4 0.56 0.05 低 否 否
PPK3 2(R)-羟基-3-丁烯基硫苷 60 11/6 0.11 -1.71 低 否 是
PPK4 7-羟基-β-咔啉-1-丙酸 55 3/3 0.56 1.35 高 否 否
PPK5 N-阿魏酰胍丁胺 46 5/4 0.55 0.93 高 否 否
PPK6 芥子酰腐胺 45 5/3 0.55 1.46 高 否 否
PPK7 3-羟基丙酸 27 3/2 0.85 -0.51 高 否 否
PPK8 芦丁 27 10/16 0.17 -1.51 低 否 是
PPK10 咖啡酸 21 4/3 0.56 0.93 高 否 否
PPK11 6-苄基氨基嘌呤 17 3/2 0.55 1.54 高 是 是
PPK12 鸢尾黄素 14 6/3 0.55 2.06 高 否 否
PPK13 4-O-咖啡酰奎宁酸 11 9/6 0.11 -0.37 低 否 否
PPK14 对苯二甲酸 11 4/2 0.85 1.13 高 否 否
PPK15 延胡索酸 10 4/2 0.85 -0.35 高 否 否
PPK16 1-甲氧基吲哚-3-甲醛 8 2/0 0.55 1.66 高 是 否
PPK17 2-吡啶甲酸 7 3/1 0.85 0.23 高 是 否
PPK18 3-羟基扁桃酸 6 4/3 0.56 0.37 高 否 否
PPK20 白杨素 4 4/2 0.55 2.55 高 是 否
PPK22 没食子儿茶素 4 7/6 0.55 1.11 高 否 否
PPK21 秦皮素 4 5/2 0.55 1.11 高 否 否

注:HBA/HBD,氢供体数/氢受体数;BO,生物利用度;GI,胃肠道吸收;BBB,血脑屏障渗透性;Pgp,是否为糖蛋白Pgp底物。

研究发现,较高的生物利用度可以有效增强植物化学物质的生物功效[39]。在本研究中,ADME动力学结果显示,大多数化合物的生物利用度为0.55或0.56,说明这些化合物可以被体内有效利用,发挥有益作用。胃肠道吸收、血脑屏障渗透性、是否为P蛋白受体以及CYP同工酶的抑制剂是化合物动力学的主要判断依据[38],综合ADME数据分析发现,6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)、呋喃酮(furoaloesone)、白杨素(chrysin)和1-甲氧基吲哚-3-甲醛(1-methoxyindole-3-carbaldehyde)的化合物动力学结果最好,说明这些化合物不仅在胃肠道表现出高吸收,还可以穿过血脑屏障,作用于脑部相关疾病。以上结果在以往研究中也得到了证实:6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)是一种细胞分裂素,可以通过与过氧化物酶结合调节抗氧化防御系统的活性[40];细胞实验发现,白杨素(chrysin)对于人肝癌细胞系(HepG2)存在较高的细胞毒性,具有抗肝癌潜力,可以有效缓解肝损伤[41]。综上,SwissADME数据库提供的ADME数据表明,6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)的药代动力学结果最好,其次是呋喃酮(furoaloesone)、鸢尾黄素(tectorigenin)、1-甲氧基吲哚-3-甲醛(1-methoxyindole-3-carbaldehyde)、咖啡酸(caffeic acid)和白杨素(chrysin)。

2.6 分子对接

为进一步验证上述所得核心化合物的准确性,选取体内分解酒精的核心蛋白乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)作为受体靶点,在PDB数据库中下载受体蛋白晶体文件:乙醇脱氢酶(ADH,PDB ID:3COS、1AGN、1HSO、1HTO),乙醛脱氢酶(ALDH,PDB ID:4WJ9、8BB8、7MJC、4QGK),分别与20个核心化合物进行分子对接,在Autodock Vina 软件中预测结合能,结果如图7a所示。以自由结合能为筛选条件,结合能<-4.25 kcal/mol 表示两者具有标准的结合能力,结合能<-5 kcal/mol表示结合良好,结合能<-7 kcal/mol表示结合力较强[42]。
图7 主要活性成分和关键靶点分子对接结合能热图(a)以及结合活性较好的化合物和靶点蛋白分子对接示意图(b~e)

注:网络版为彩图。

Fig.7 Heat map of docking binding energy between main active components and key target molecules (a) and schematic diagram of docking between compounds with good binding activity and target protein molecules (b~e)

结果表明,关键靶点和主要活性成分的结合能介于-9.5~-3.4 kcal/mol,高达19种化合物与核心靶标的结合能<-4.25 kcal/mol,其中有近一半化合物的结合能≤-7 kcal/mol,说明滇黄精经九蒸九制炮制后所富集的化合物大多能与ADH、ALDH较好的结合进而发挥保肝功效。芦丁(rutin)的整体结合效果最好,和ALDH(8BB8)的结合能最低,为-9.5 kcal/mol(图7b),接下来依次是没食子儿茶素(gallocatechin)、呋喃酮(furoaloesone)、4-O-咖啡酰奎宁酸(4-O-caffeoylquinic acid)。其中,没食子儿茶素(gallocatechin)和ALDH(8BB8,图7c)、呋喃酮(furoaloesone)和ALDH(4WJ9,图7d)、4-O-咖啡酰奎宁酸(4-O-caffeoylquinic acid)和ADH(1HTO,图7e)呈现出较低的结合能,分别为-8.9、-8.5、-8.5 kcal/mol。除以上4种化合物之外,鸢尾黄素(tectorigenin)、咖啡酸(caffeic acid)、白杨素(chrysin)、6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine)、N-阿魏酰胍丁胺(N-feruloylagmatine)等都表现出较好的结合潜能,结合能大都小于-7 kcal/mol。
研究表明,酒精性肝损伤可能和酒精代谢过程中的主要催化酶ADH和ALDH密切相关,它们的相对反应速率决定了血液中乙醇和乙醛的浓度[2,21],过量饮酒会增加ADH含量,降低ALDH含量,延缓乙醛向乙酸转化的速度,导致乙醛在血液中浓度大幅提升,引发乙醛中毒。因此,本研究通过分子对接预测了核心化合物与ADH、ALDH的结合能力,验证了PPK的核心活性成分与酒精代谢关键催化酶具备较好的结合潜能,证实了这些活性成分治疗酒精性肝损伤的可能性。

3 结论

本研究通过构建酒精损伤LO2细胞模型证实了PPK的保肝潜能,基于UPLC-MS/MS和生物信息数据库探究了PPK对酒精性肝损伤的保护作用及机制,筛选出芦丁、呋喃酮、咖啡酸等20种核心功效成分,通过PI3K-Akt、AMPK、NF-κB、cAMP等信号通路,调控肝脏的氧化应激和炎症发生,缓解酒精性肝损伤。通过药代动力学分析和分子对接虚拟筛选,对PPK的核心成分及作用靶点进行了进一步验证。本研究初步探究PPK解酒保肝的潜在作用机制,为传统药食同源植物滇黄精的功能性产品研发提供理论参考。

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