糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种常见的慢性代谢性疾病。全球成年糖尿病患者约有5.37亿人,发病率高达10.5%,其中2型糖尿病(type Ⅱ diabetes mellitus,T2DM)约占糖尿病总数90%[1]。糖尿病是认知障碍发生的危险因素,研究发现T2DM患者发生认知功能障碍的风险比非糖尿病人群增加50%以上[2],并且T2DM患者还是阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的高危人群[3]。因此,在我国人口老龄化的大背景下,减少和减轻糖尿病相关的认知障碍,对提高患者生活质量具有重要意义。
血管内皮功能损害与认知障碍关系密切[4]。研究发现糖尿病微血管并发症(如糖尿病视网膜病变)或大血管并发症(如心肌梗死或中风)患者认知能力较差[5]。在糖尿病患者中,高血糖引起的脑血流减少可导致缺氧神经元病理改变[6]进而引起细胞骨架的重塑,导致血管通透性增加,降低神经元活性[7]。糖尿病引起的内皮功能障碍还可上调神经细胞凋亡和炎症反应,参与神经元凋亡变性、轴突和白质损伤[8],炎症参与神经原纤维缠结和β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)形成[9]。这些病理变化可能参与了糖尿病相关认知障碍的形成过程。但是,目前糖尿病相关认知障碍的具体机制仍不明确。
miRNA是一类小的非编码RNA,参与细胞凋亡、存活和表型的发展。研究表明miR-126高表达于内皮细胞,发挥血管保护作用,但在糖尿病患者心血管系统中表达水平降低[10]。内皮miR-126表达的降低可能介导血管性认知障碍[11],这可能是糖尿病认知障碍的发病机制之一。有氧运动干预是糖尿病患者控制血糖的有效手段,是预防认知障碍下降的非药物性方法。但是有氧运动改善认知功能的分子机制知之甚少。研究发现有氧运动可上调血清和血管miR-126表达,降低血管炎症反应,缓解血管内皮细胞损伤[12]。但有氧运动通过调节miR-126改善糖尿病认知功能的机制尚不清楚。因此,本文通过对糖尿病小鼠进行有氧运动干预后,观察小鼠学习记忆能力改变,检测海马组织中miR-126及其下游靶基因高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein,HMGB1)的炎症相关蛋白表达变化,探讨miR-126在运动保护糖尿病小鼠认知功能中的作用及分子机制,以期为运动改善糖尿病认知障碍提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及运动方案
15周龄的雄性二型糖尿病小鼠(简称:db/db小鼠)12只,对照组正常小鼠(简称:m/m小鼠)6只(购于江苏卡文斯,许可证编号No.201916545)饲养于武汉体育学院SPF级动物实验中心。小鼠分笼饲养,自由进水进食。
1.2 主要仪器与试剂
酶标仪 (赛默飞)、无创血压仪 BP-2010A(北京软隆)、正置荧光显微镜(奥林巴斯)、垂直电泳槽及电转仪(Bio-Red)、实时荧光定量 PCR 仪 CFX Connect(Bio-Red)、Nano-100 微量分光光度计(杭州奥盛)、ZS-PT 小动物实验跑台。PCR试剂购于Takara公司,主要抗体包括 Aβ(proteintech)、HMGB1(abcam)、RAGE(abcam)、ERK1/2(immunoway)、GAPDH(CST)、Caspase3(CST)、NF-κB(CST)、β-actin(CST)、GFAP(CST)、NeuN(CST)。
1.3 Morris水迷宫方案
运动干预结束后第2天开始进行水迷宫实验。目标象限:位于第Ⅲ象限,水温23 ℃,水深40 cm,站台在水面下2 cm左右,周围遮光。分析系统采集时间为1 min。小鼠面朝泳池液面上2 cm处入水。系统自动捕捉小鼠的游泳轨迹。定向导航实验:小鼠各个象限入水监测1 min内小鼠找到站台的时间,连续4 d。空间探索实验:第5天,去除站台,小鼠从各个象限入水监测,记录小鼠1 min内的运动速度和目标象限中的游泳时间。
1.4 动物取材
水迷宫实验结束后24 h取材,取血清及海马组织,部分置于4%多聚甲醛中,用于制作切片;其余于冻存管-80 ℃保存。
1.5 海马组织切片
1.5.1 HE染色
冰冻切片固定,清水洗涤。之后苏木素染色、伊红染色、再次脱水、中性树胶封片。显微镜下观察,图像采集后用Image J软件分析。
1.5.2 免疫荧光
冰冻切片烘烤后,用4%的多聚甲醛固定,洗涤,抗原修复,洗涤,3%BSA封闭。加入一抗NeuN(1∶200)、GFAP(1∶200),4 ℃孵育过夜,洗涤后加荧光二抗FITC山羊抗小鼠IgG(1∶50)、CY3山羊抗小鼠IgG(1∶50),洗涤,加DAPI染液。封片,在光学显微镜下观察,用Image J软件分析,每张片取5个视野记录阳性细胞,统计取平均数。
1.6 血清和血压指标
测空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)前禁食12 h,每2周一次。鼠尾末取血,血糖试纸吸取血液后在血糖仪上读数。
ELISA试剂盒复温至室温检测血清胰岛素(insulin, INS)。分别加梯度标准品及样本各25 μL、孵育生物化抗体、洗涤、孵育酶结合工作液、洗涤、显色、终止反应、读数。酶标仪在450 nm波长时立刻读取各孔OD值。根据标准品浓度和OD值做标准曲线,根据样本OD值计算样本浓度。
在运动干预前称重,每2周1次。干预前和干预第8周测量,小鼠无创血压系统压脉套套至尾根部,待小鼠安静后机器开始自动测量收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)和心率(heart rate, HR)。
1.7 实时荧光定量PCR
取海马组织检测miR-126,Trizol法提取总RNA,微量分光光度计测定所抽提RNA的浓度。RNA反转录cDNA条件:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s。反转录引物为mmu-miR-126(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA-TACGACCGCATTAT-3')。荧光定量PCR扩增cDNA的反应条件为:预变性95 ℃,30 s;变性95 ℃,5 s;40个循环;退火延伸60 ℃,30 s。溶解曲线采集,数据分析采用 方法。
1.8 蛋白免疫印迹法
海马组织和裂解液放入匀浆管,匀浆离心,重复3个循环,超声离心取上清液即为提取的蛋白。用微量分光光度计,测试蛋白浓度。蛋白样本上清液中加入样本体积1/4的5倍浓缩的上样缓冲液,混匀后100 ℃金属浴加热10 min,样本制备完毕后转移到-20 ℃保存。制备12%分离胶和5%浓缩胶,上样、电泳、转膜。转膜条件:电流恒定350 mA,时间根据蛋白分子量调整,为60~100 min。PVDF膜在封闭液(5%脱脂奶粉+TBST)中,室温摇床封闭1 h,TBST漂洗;一抗孵育,4 ℃孵育过夜,TBST漂洗;放入相应的二抗中,室温摇床孵育1 h,TBST漂洗。用ECL显影液曝光,Image J软件进行灰度值分析。
1.9 统计分析
使用GraphPad Prism 8分析。数据用平均数±标准差表示。组间比较使用单因素方差分析,相关分析使用Pearson相关系数。P<0.05表示有统计学差异,P<0.01有显著统计学差异。
2 结果
2.1 运动对糖尿病小鼠体质量、心率、血压、FBG和INS的影响
如图1 所示,糖尿病小鼠的体重随周龄增长。第8周时DE组体重显著低于DC组(P<0.001)。
干预前,DC组、DE组心率显著高于MC组(P<0.001);第8周时,DE组心率显著低于DC组(P<0.001)。干预前DC组、DE组SBP和DBP显著高于MC组(P<0.001, P<0.01),第8周时,DE组SBP和DBP显著低于DC组(P<0.001,P<0.01)。在4~8周时段中,DC组血糖显著高于MC组(P<0.001);DE组血糖显著低于DC组(P<0.05)。
2.2 运动对糖尿病小鼠海马组织形态学的影响
如图2a所示,在第8周,DE、DC组血清胰岛素显著高于MC组(P<0.001);DE组血清胰岛素显著低于DC组(P<0.01)。
如图2b所示,DC组海马CA1区锥体细胞排列疏松,分层紊乱,框中可见细胞断裂,细胞体积异常,核不均匀的情况;MC组和运动后DE组锥体细胞排列紧密,层次清晰,细胞形状规整。
如图2c所示,与MC组比,DC组miR-126表达显著降低(P<0.05);8周运动干预后,DE组海马组织的miR-126显著高于DC组(P<0.05)。
如图2所示,小鼠游泳速度和miR-126-5p表达高度相关(r2=0.96,P<0.01),小鼠目标象限时间百分比和miR-126-5p表达相关(r2=0.75,P<0.01),小鼠第4天逃避潜伏期和miR-126-5p表达负相关(r2=-0.65,P<0.01)。这表明海马组织miR-126与糖尿病小鼠的认知功能密切相关。
2.3 运动对糖尿病小鼠海马组织神经元数量和星型胶质细胞的影响
如图3所示,在海马荧光切片的DG区、CA1区、CA3区可见红色荧光为NeuN组神经元,与MC组比,DC组神经元在3个区域数量显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05),8周运动干预后,DE组神经元数量显著高于DC组(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。
图3 小鼠海马区NeuN和GFAP免疫荧光A.小鼠海马荧光染色,第1行为海马整体观,红色荧光为NeuN神经元,绿色荧光为GFAP星型胶质细胞,蓝色荧光为细胞核,第2~4为行海马不同分区,依次为DG区、CA1区、CA3区;B.海马DG区、CA1区、CA3区NeuN神经元核阳性细胞数;C.海马DG区、CA1区、CA3区图神经胶质细胞活化面积百分比。DG区:*与MC组比较,#与DC组比较。CA1区:a与MC组比较,b与DC组比较。CA2区:c与MC组比较,d与DC组比较。 **P<0.01,***P<0.001, ###P<0.001,a代表P<0.05,aa代表P<0.01,b代表P<0.05,bbb代表P<0.001,c代表P<0.05,ccc代表P<0.001,d代表P<0.05,ddd代表P<0.001。 Fig.3 NeuN and GFAP immunofluorescence in the hippocampus of mice |
如图3所示,在海马组织荧光切片中可见绿色荧光为GFAP星型胶质细胞,与MC组比,DC组星型胶质细胞活化面积在DG、CA1、CA3区显著升高(P<0.001,P<0.01,P<0.001);8周运动干预后,DE组星型胶质细胞活化面积显著低于DC组(P<0.01)。
2.4 运动对各组小鼠认知功能的影响
2.4.1 运动提高糖尿病小鼠定向导航能力
如表1所示,随训练天数的增加,各组小鼠逃避潜伏期依次缩短。前4天中相比MC组,DC组逃避潜伏期显著升高 (P<0.05),第2天开始DE组逃避潜伏期显著低于DC组(P<0.001)。
表1 小鼠定向导航和空间探索结果Tab.1 The results of mice directional exploration and space exploration |
| 测试项目 | MC | DC | DE |
|---|---|---|---|
| 第1天逃避潜伏期/s | 57.54±1.48 | 59.90±0.13* | 59.65±0.30 |
| 第2天逃避潜伏期/s | 53.17±2.41 | 59.33±1.07*** | 56.08±1.33### |
| 第3天逃避潜伏期/s | 43.53±2.73 | 57.66±2.05*** | 49.38±2.05### |
| 第4天逃避潜伏期/s | 28.33±1.43 | 56.74±2.83*** | 33.09±1.59### |
| 第5天目标象限时间百分比/% | 42.05±2.29 | 20.64±4.73*** | 39.42±4.93### |
| 第5天游泳速度/(cm·s-1) | 18.34±1.11 | 9.25±1.11*** | 12.85±1.86## |
注:*与MC组比较,#与DC组比较。*P<0.05, ***P<0.001,##P<0.01,###P<0.001。 |
2.4.2 运动提高糖尿病小鼠空间探索
如表1所示,水迷宫第5天,对三组小鼠目标象限时间百分比、游泳速度进行比较。DC组比MC组各项指标均显著降低(P<0.001),DE组目标象限时间百分比和游泳速度显著高于DC组(P<0.01)。
2.5 运动对各组小鼠海马组织相关蛋白表达的影响
2.5.1 糖尿病小鼠认知功能和海马神经元凋亡蛋白表达
如图4所示,8周运动干预后, DC组Aβ、p-tau显著高于MC组 (P<0.01), DE组Aβ、p-tau显著低于DC组 (P<0.01)。 8周运动干预后,DC组Bax、Caspase3显著高于MC组(P<0.01),DE组显著低于DC组(P<0.001,P<0.05);DC组Bcl-2、Bcl-2/Bax显著低于MC组(P<0.05),DE组Bcl-2、Bcl-2/Bax显著高于DC组(P<0.05)。
2.5.2 糖尿病小鼠海马组织HMGB1等炎症蛋白表达
3 分析与讨论
3.1 糖尿病与认知障碍
糖尿病主要特征为高血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗。db/db小鼠是一种常见的T2DM动物模型,可在出生10 d左右出现高胰岛素血症,4~8周出现高血糖,并在12~16 周时出现明显的冠状动脉血管壁增厚等病理变化及并发症。本实验选用15周龄db/db小鼠,适应运动1周后开始正式实验。海马是内侧颞叶内的结构,在空间导航和情景记忆中发挥关键作用。每当动物穿过环境的特定区域时,海马的CA1区神经元就会发出信号,进行空间导航和情节记忆[15]。本实验通过Morris水迷宫判断学习记忆能力,发现DC组出现认知能力损害,表现在定向导航中逃避潜伏期长,空间探索、游泳速度、目标象限探索时间百分比的显著下降。
糖尿病相关的认知功能障碍取决于多种因素,有微血管表现或大血管疾病的糖尿病患者认知能力表现较差,痴呆风险更高。一项长达10年的流行病学调查显示糖尿病性脑血管疾病促进非遗忘性轻度认知障碍的发生[16]。糖尿病患者的血糖增高会促使脑组织炎症的发生,导致内皮细胞凋亡,血管通透性增加,血管管径缩窄,微血管循环减少和有效血流灌注降低[17]。高血糖和胰岛素促使血管的炎症发生,进一步导致血脑屏障(blood brain barrier, BBB)通透性发生变化,促使Aβ在脑组织中沉积[18]。本实验发现:相较于MC组,DC组的Aβ、p-tau都显著增加(见图4)。在血管性痴呆大鼠模型中发现记忆功能减退与Aβ和p-tau蛋白表达增加有关,Aβ和p-tau蛋白是老年斑的主要成分,Aβ可刺激NF-κB信号传导,导致炎症性细胞因子的分泌[19]。海马组织的炎症反应相关蛋白HMGB1、ERK1/2、RAGE和NF-κB表达均有不同程度的增加(见图4和5)。血清HMGB1水平在高血糖时升高,在胰岛素治疗后下降[20]。它可以上调炎症因子白细胞介素-1β[21]和RAGE/ERK,增加机体炎症反应[22]。本研究与之前研究结果相似,说明糖尿病db/db小鼠的海马组织炎症反应明显。
凋亡是机体常见的生理过程,Bcl-2是一种抗凋亡蛋白,Bcl-2/Bax降低提示有凋亡的风险。本研究发现糖尿病小鼠的Casepase-3凋亡蛋白表达增加(见图4),这说明海马组织的炎症反应和细胞凋亡可能是糖尿病小鼠学习和记忆能力下降的原因。
3.2 miR-126与糖尿病认知障碍
MicroRNA是一类新的内源性有调控功能的非编码小RNA,具有减轻/预防各种疾病病理重塑的潜力, 使之成为疾病的治疗靶点。miR-126是在内皮细胞中特异性高表达的一类非编码RNA,参与调节血管发育、新生血管形成以及血管炎症反应等生理和病理生理过程[23]。在T2DM患者中,miR-126是长期全因死亡的重要且独立的预测因子,也可能是心血管并发症的表观遗传预测因子[24]。此外,多项研究表明在高血糖条件下,miR-126在循环系统中的浓度降低[25]。对AD患者进行简易精神状态检查(MMSE)评估,发现miR-126水平的高低能够区分轻度和重度认知障碍[26]。以小动脉硬化和腔隙性梗死为特征的微血管病变,会导致皮质和皮质下微梗死,是认知障碍的最严重病理基础[27]。研究还发现内皮miR-126表达的降低可能介导多发性微梗死诱导的血管性认知障碍[11]。敲除miR-126的小鼠表现出显著的认知障碍,髓鞘密度和轴突密度降低,以及神经炎症增加[11]。本研究发现海马组织DC组较MC组miR-126出现显著下降。通过对小鼠空间探索能力和海马组织miR-126表达相关性分析,发现小鼠游泳速度和目标象限时间百分比都与海马组织miR-126表达高相关。进一步证实海马组织的miR-126表达在糖尿病认知障碍中起重要作用。
糖尿病血管认知障碍的主要机制可能由内皮损伤介导,而通过miR-126抗炎作用可能是糖尿病患者认知的重要调节因子。使用内皮祖细胞来源的外泌体富含miR-126治疗T2DM中风小鼠,可显著改善神经和认知功能,增加轴突密度、髓鞘密度、血管密度、动脉直径,并在缺血边界区诱导M2巨噬细胞极化,延迟或减弱向促炎表型M1型的转变,减少炎症作用[28]。HMGB1是miR-126-5p的靶基因[29]。已知HMGB1可响应外源和内源性刺激而从细胞核释放到细胞外环境中,随后它与已知受体RAGE结合,激活ERK1/2和NF-κB,介导其他炎症因子的产生和释放,例如TNF-α、IL-1β、IL-6等[30],参与内皮细胞多种炎症因子基因的表达和调控 [31]。研究还发现星形胶质细胞来源的HMGB1,可通过直接作用于脑微血管内皮细胞增加其免疫细胞浸润及炎症反应,促进脑脊髓炎的发生发展[32]。而在海马组织炎症反应中,HMGB1表达增加是减少神经发生的重要影响因素,会影响学习和记忆能力[33]。本实验结果发现糖尿病小鼠海马组织中miR-126表达的下降,星形胶质细胞活化降低,HMGB1、RAGE和NF-κB蛋白表达的增加,可能是造成糖尿病小鼠学习记忆能力下降的重要机制。
3.3 有氧运动上调miR-126改善糖尿病认知障碍
在本实验中,对小鼠海马区组织HE染色观察发现,运动干预后DE组神经元细胞排列较之DC组紧密,整齐,细胞形状规整;并且通过对海马进行免疫荧光,运动干预后表现出神经元荧光强度增加,星型胶质细胞活化减小。我们还发现DE组Bcl-2及Bcl-2/Bax增高,运动减少了海马组织的细胞凋亡。说明有氧运动可以保护海马神经元细胞,同时抑制了星形胶质细胞。星形胶质细胞释放的炎性因子HMGB1是脑组织炎症反应的机制之一[32]。本文发现糖尿病小鼠运动后在海马组织中miR-126表达上升,炎症相关的HMGB1、RAGE和NF-κB下降。与以往的研究表明有氧运动能显著提高AD患者脑血流[37],提高AD小鼠脑神经营养因子BDNF、胰岛素生长因子的表达促进血管生成和神经发生等[38]作用机制不同,实验数据表明有氧运动激活了miR-126/HMGB1通路降低糖尿病海马组织炎症反应。因此,本文结果说明有氧运动是通过上调miR-126表达改善糖尿病小鼠的认知功能,也进一步提示抑制炎症反应是有氧运动的治疗靶点之一,而运动是否通过上调海马组织的miR-126降低星形胶质细胞的活化还需要进一步研究。
4 结论
本实验通过内皮特异性表达的miR-126作为调控切入点来研究有氧运动对糖尿病小鼠认知障碍的影响。研究发现8周中等强度有氧运动可改善糖尿病小鼠的学习记忆能力,减轻海马组织的细胞凋亡和炎症反应,其机制可能与增加海马组织miR-126含量,抑制HMGB1和NF-κB蛋白表达有关。在进一步的研究中,需要验证运动通过上调miR-126减少的HMGB1是否来源于星形胶质细胞,并通过富含miR-126的外泌体对糖尿病小鼠进行治疗是否能达到改善认知障碍的作用。