新型N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物的合成及其抗肿瘤活性

王伟; 冯志娟; 吕梦娇; 张娅玲; 侯佳威; 李宝林

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2024203

陕西师范大学学报(自然科学版) >

2024 , Vol. 52 >Issue 1: 29 - 38

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024203

活性材料构筑及性能研究专题

新型N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物的合成及其抗肿瘤活性

王伟 ,
冯志娟 ,
吕梦娇 ,
张娅玲 ,
侯佳威 ,
李宝林 ^,^*

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陕西师范大学化学化工学院,陕西西安 710119

*李宝林,男,教授,博士生导师,研究方向为天然药物化学和有机合成化学。E-mail: baolin@snnu.edu.cn

Copy editor: 焦阳

收稿日期: 2023-06-01

网络出版日期: 2024-02-28

基金资助

国家自然科学基金(82201493)

收起

Synthesis and antitumor activities of novel heterozygous N-substituted isatin-quinazoline compounds

WANG Wei ,
FENG Zhijuan ,
LYU Mengjiao ,
ZHANG Yaling ,
HOU Jiawei ,
LI Baolin ^,^*

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School of Chemistry & Chemical Engineering, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, Shaanxi, China

Received date: 2023-06-01

Online published: 2024-02-28

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摘要

以N'-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒和靛红为起始原料,N'-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒先与芳胺发生Dimroth重排,再进行Suzuki偶联生成化合物4a~4c;靛红经1-位取代、3-位成腙生成化合物7a~7c;最后经化合物4a~4c和7a~7c之间的亲核加成,合成了9个新型N-取代的靛红杂合喹唑啉类化合物8a~8i。利用核磁共振、红外光谱和高分辨质谱对目标化合物进行表征,并以SW480、A431、NCI-H1975和A549人肿瘤细胞为受试细胞,采用MTT法对9个目标化合物的抗肿瘤活性进行评价。结果表明:大部分化合物均具有较强的肿瘤细胞增殖抑制作用,其中化合物8a、8b、8e、8g对4种受试细胞均具有良好的生长抑制作用,优于阳性对照拉帕替尼和吉非替尼。可见,当在喹唑啉单元4-位引入3-乙炔基苯氨基时,对肿瘤细胞的增殖抑制活性较好;当引入3-氯-4-氟苯氨基和3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基时,对肿瘤细胞的增殖抑制活性次之。当靛红单元5-位无取代基或被F取代时,对肿瘤细胞的增殖抑制活性较好;当被Cl取代时,对肿瘤细胞的增殖抑制活性较差。

关键词： N-取代靛红; 喹唑啉; 化合物合成; 抗肿瘤活性

本文引用格式

王伟 , 冯志娟 , 吕梦娇 , 张娅玲 , 侯佳威 , 李宝林 . 新型N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物的合成及其抗肿瘤活性[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2024 , 52(1) : 29 -38 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024203

Abstract

Nine novel heterozygous N-substituted isatin-quinazoline compounds (8a~8i) were synthesized using N'-(2-cyano-4-iodophenyl)-N,N-dimethylformamidine and isatin as the starting materials. Dimroth rearrangement of N'-(2-cyano-4-iodophenyl)-N,N-dimethylformamidine with arylamines, and subsequently Suzuki coupling with 2-formylfuran-5-boronic acid gave compounds 4a~4c. Meanwhile, compounds 7a~7c were synthesized by the substitution and hydrazone reactions of isatin at 1-position and 3-position, respectively. Finally, nine target compounds (8a~8i) were formed through nucleophilic addition reaction of 4a~4c and 7a~7c. The chemical structures of the synthesized compounds were characterized by NMR, IR and HRMS. The antitumor activities of these compounds on human colorectal carcinoma cells SW480, human epidermoid squamous carcinoma cells A431, human non-small cell lung cancer cells NCI-H1975 and A549 were tested through MTT method in vitro.The results indicated that most of the compounds had significant inhibition effect on the growth of tumor cells. Among which, compounds 8a, 8b, 8e, 8g showed higher inhibitory activities on the proliferation of four cell lines than the positive controls of Lapatinib and Gefitinib. It can be seen that the activity of inhibiting tumor cell proliferation was good when the 4-position of quinazoline unit was 3-ethynylphenylamino, and compounds bearing 3-chloro-4-fluorophenylamino or 3-chloro-4-(3-fluorobenzyloxy)phenylamino at the 4-position of quinazoline unit also showed relatively good activity of inhibiting tumor cell proliferation. When the 5-position of isatin unit had no substituent or was substituted by F, the activity of inhibiting tumor cell proliferation was good, but the inhibiting activity was poor when the 5-position of isatin unit was substituted by Cl.

Key words： N-substituted isatin; quinazoline; compound synthesis; antitumor activity

近年来,随着对肿瘤细胞信号传导途径研究的不断深入,以酪氨酸激酶为靶点的治疗成为癌症治疗效果较好的方法之一^[1]。喹唑啉类化合物,如已上市的抗肿瘤药物拉帕替尼(Lapatinib,图1a)^[2-3]、吉非替尼(Gefitinib,图1b)^[4-5]和埃罗替尼(Erlotinib,图1c)^[6]等,是活性较高、选择性较好的一类小分子酪氨酸激酶抑制剂。其中,拉帕替尼是首个可口服的双靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂,它可以同时作用于表皮生长因子受体EGFR和HER-2,抑制其活性,阻止表皮生长因子受体过度表达,抑制癌细胞增殖^[7]。然而,上述抗肿瘤药物在使用一段时间后会产生耐药性,同时也具有一定的毒副作用,易引发腹泻、恶心、呕吐、皮疹及肝损伤等症状。

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图1 部分抗肿瘤化合物的结构式

Fig.1 The structures of some compounds with antitumor activities

靛红,又名1-氢-吲哚-2,3-二酮,是人体组织中一种内源性杂环分子^[8],也是海洋生物维持生存所必需的一种天然活性物质,具有多种药理活性^[9-10]。目前,对靛红的研究包括1-位N原子上的取代、2-位和3-位羰基碳修饰以及苯环修饰,其中修饰3-位羰基碳所得化合物的抗肿瘤活性最高,如3-芳基亚甲基靛红衍生物^[11]、靛红-3-腙衍生物^[12]、靛红-3-亚胺金属配合物^[13]和C3-靛红螺环衍生物^[14-15]等。研究表明,靛红类化合物可作用于血管内皮细胞生长因子受体VEGFR-2、成纤维细胞生长因子受体FGFR-1等,通过抑制其过度表达而诱导肿瘤细胞凋亡^[16]。已上市的含靛红结构单元的抗肿瘤药物如舒尼替尼(Sunitinib,图1d)^[17-18]、托西尼布磷酸盐(Toceranib phosphate)^[18]可用于治疗肾癌、胃肠道肿瘤等疾病,说明靛红衍生物在抗肿瘤方面具有药用价值。

部分靶向药物服用一段时间后会产生耐药性,而将2个或2个以上具有不同药效或互补药效的生物片段进行杂合,其协同作用能够增强癌症治疗效果^[19]。鉴于上述喹唑啉类化合物和靛红衍生物在抗肿瘤方面的良好效果,本研究拟采用药效基团杂合的方式^[20],在课题组前期工作的基础上^[21],以拉帕替尼的药效基团喹唑啉环为母核,4-位分别连接不同的芳氨基结构单元,6-位连接呋喃甲醛基结构单元,并进一步在醛基上连接靛红腙结构单元。基于以上设计思路,进行结构新颖的N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物的合成,并对所合成化合物进行初步的抗肿瘤活性研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

核磁共振仪,Bruker Avance 600 MHz,四甲基硅烷作为内标;红外光谱仪,Bruker Fensor 27;高分辨质谱仪,Bruker Esquire 3000plus;显微熔点测定仪,X-6,北京泰克仪器有限公司。

所用试剂均为市售分析纯。所用受试细胞株人结肠癌细胞SW480、人皮肤鳞状细胞癌细胞A431、人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975和A549均购自中国科学院细胞库。

1.2 实验方法

本研究共合成9个结构新颖的N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物(8a~8i),其合成路线如图2所示。

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图2 目标化合物的合成路线

A:CH₃COOH,130 ℃,20 min;B:5% Pd/C,乙二醇二甲醚,MeOH,Et₃N,50 ℃,3 h;C:CHCl₃,H₂O,K₂CO₃,40 ℃,4 h;D:CH₃OH,65 ℃,30 min;E:C₂H₅OH,N,N-二甲基甲酰胺,CH₃COOH,79 ℃,6 h。

Fig.2 The synthetic routes of target compounds

1.2.1 化合物3a~3c的合成

称取N'-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒(2.99 g,10.0 mmol)和芳胺化合物2a~2c(11 mmol)于圆底烧瓶中,加入5 mL冰乙酸溶解,130 ℃反应20 min,冷却至室温。减压旋蒸除去冰乙酸,向体系中加入20 mL蒸馏水,并用浓氨水调节pH值为9~10,室温下搅拌30 min。抽滤,水洗滤饼,所得滤饼经硅胶柱色谱分离(洗脱剂中V_乙酸乙酯∶V_石油醚=1∶6),得到白色固体即为化合物3a~3c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-碘喹唑啉(3a)^[7],白色固体3.05 g,收率为83%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-碘喹唑啉(3b)^[7],白色固体3.48 g,收率为88%。

4-[3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基]-6-碘喹唑啉(3c)^[7],白色固体4.55 g,收率为91%。

1.2.2 化合物4a~4c的合成

称取化合物3a~3c(6 mmol)、5-甲酰基呋喃-2-硼酸(1.12 g,8.0 mmol)、5% Pd/C (0.56 g)于圆底烧瓶中,加入40 mL乙二醇二甲醚和20 mL甲醇,并加入三乙胺(2.42 g,24 mmol),50 ℃反应3 h。趁热抽滤,滤饼用四氢呋喃洗涤,将滤液减压旋蒸除去溶剂,所得浓缩物经硅胶柱色谱分离(洗脱剂中V_乙酸乙酯∶V_氯仿 =1∶15),得到橘黄色固体即为化合物4a~4c。

4-(3-乙炔基苯氨基)-6-(5-甲酰基呋喃-2-基)喹唑啉(4a)^[7],橘黄色固体1.44 g,收率为71%。

4-(3-氯-4-氟苯氨基)-6-(5-甲酰基呋喃-2-基)喹唑啉(4b)^[7],橘黄色固体1.85 g,收率为85%。

4-[3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基]-6-(5-甲酰基呋喃-2-基)喹唑啉(4c)^[22],橘黄色固体2.44 g,收率为86%。

1.2.3 化合物6a~6c的合成

称取化合物5a~5c(10 mmol)、碳酸钾(5.53 g,40 mmol)于圆底烧瓶中,加入10 mL氯仿;称取N,N-二乙氨基氯乙烷盐酸盐(3.44 g,20 mmol)于另一个圆底烧瓶中,加入9 mL水。将N,N-二乙氨基氯乙烷盐酸盐水溶液加入装有化合物5a~5c的圆底烧瓶中,室温剧烈搅拌10 h。反应完全后,用氯仿(30 mL)萃取2次,有机相合并,并用无水硫酸镁干燥,减压旋蒸除去溶剂,所得浓缩物经硅胶柱色谱分离(洗脱剂中V_甲醇∶V_乙酸乙酯 =1∶80),得到红色油状液体即为化合物6a~6c。

1-(2-二乙氨基乙基)-1-氢-吲哚-2,3-二酮(6a),红色油状液体1.55 g,收率为63%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-1-氢-吲哚-2,3-二酮(6b),红色油状液体1.79 g,收率为68%。

1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-1-氢-吲哚-2,3-二酮(6c),红色油状液体2.34 g,收率为83%。

1.2.4 化合物7a~7c的合成

称取化合物6a~6c (5 mmol)于圆底烧瓶中,加入15 mL甲醇和6.5 mL水合肼(80%),65 ℃回流30 min。待反应液冷却后,减压旋蒸除去溶剂,所得浓缩物经硅胶柱色谱分离(洗脱剂中V_甲醇∶V_乙酸乙酯 =1∶80),得到亮黄色油状液体即为化合物7a~7c。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-3-腙吲哚啉-2-酮(7a),亮黄色油状液体1.06 g,收率为82%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氟-3-腙吲哚啉-2-酮(7b),亮黄色油状液体1.12 g,收率为80%。

(Z)-1-(2-二乙氨基乙基)-5-氯-3-腙吲哚啉-2-酮(7c),亮黄色油状液体1.11 g,收率为76%。

1.2.5 化合物8a~8i的合成

称取化合物4a~4c(0.3 mmol)、化合物7a~7c(0.3 mmol)于圆底烧瓶中,加入7 mL无水乙醇和0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后,再加入0.3 mL冰乙酸,79 ℃回流6 h。冷却至室温,减压旋蒸除去溶剂,所得浓缩物在甲醇-四氢呋喃(THF)混合物中重结晶,得到红色固体即为化合物8a~8i。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)吲哚啉-2-酮(8a),红色固体0.136 g,收率为78%。熔点:242.0~244.4 ℃; HRMS: C₃₅H₃₂N₇O₂, [M+H]⁺: 582.261 4(计算值582.261 7); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.16 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.48 (d, J=6.4 Hz, 1H), 8.36 (d, J=8.2 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.03 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.93 (d, J=8.9 Hz, 1H), 7.66~7.65 (m, 1H), 7.54~7.49 (m, 2H), 7.47 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.29 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.25 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.22~7.17 (m, 1H), 4.26 (s, 1H), 4.12 (brs, 2H), 3.49 (brs, 2H), 3.24 (brs, 4H), 1.19 (brs, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.1, 157.7, 157.0, 155.0, 152.3, 151.0, 150.0, 149.2, 146.0, 144.4, 139.4, 133.5, 129.6, 129.3, 129.0, 126.9, 126.7, 124.9, 123.3, 123.1, 122.6, 121.9, 119.2, 116.7, 115.5, 110.6, 109.5, 83.4, 80.7, 48.6, 46.4, 34.8, 8.7; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 448, 2 929, 1 714, 1 608, 1 533, 1 384, 1 161, 842, 746, 590。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8b),红色固体0.134 g,收率为75%。熔点:253.5~256.2 ℃; HRMS: C₃₅H₃₁FN₇O₂, [M+H]⁺: 600.252 1 (计算值600.252 3); ¹H NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.11(s, 1H), 9.08(s, 1H), 8.77(s, 1H), 8.67(s, 1H), 8.32(d, J=8.6 Hz, 1H), 8.24(dd, J=8.0、2.0 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.96(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.90(d, J=8.6 Hz, 1H), 7.68(d, J=3.5 Hz, 1H), 7.50 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.45 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.41 (td, J=8.7、2.7 Hz, 1H), 7.29~7.28 (m, 2H), 4.21 (s, 1H), 4.14 (brs, 2H), 3.41 (brs, 2H), 3.29~3.22 (m, 4H), 1.22 (t, J=6.7 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.0, 159.0, 157.8, 157.4, 157.3, 154.1 (d, ¹J_C-F=270 Hz), 150.8, 149.9, 149.1, 140.6, 139.2, 129.1, 128.9, 128.7, 127.1, 126.7, 125.2, 123.7, 123.0, 121.8, 119.6(d, ²J_C-F=23.4 Hz), 119.4, 117.3 (d, ³J_C-F=8.9 Hz), 116.4 (d, ²J_C-F=26.1 Hz), 115.5, 110.8, 110.7 (d,³J_C-F=8.2 Hz), 83.4, 80.6, 47.8, 46.4, 34.7, 8.3; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 490, 2 974, 1 716, 1 573, 1 533, 1 384, 1 164, 1 028, 847, 574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-乙炔苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8c),红色固体0.141 g,收率为76%。熔点:278.7~281.0 ℃;HRMS: C₃₅H₃₁ClN₇O₂, [M+H]⁺: 616.221 8(计算值: 616.222 8); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.13 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.55 (brs, 1H), 8.37 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.91 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.65 (d, J=3.1 Hz, 1H), 7.61 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.50 (d, J=3.1 Hz, 1H), 7.45 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.31~7.27 (m, 2H), 4.23 (s, 1H), 4.14 (brs, 2H), 3.40 (brs, 2H), 3.26 (brs, 4H), 1.21~1.20 (m, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.7, 157.8, 157.2, 155.0, 153.2, 150.8, 148.9, 142.9, 139.1, 132.6, 129.0, 128.9, 128.6, 127.1, 126.6, 125.4, 124.3, 123.1, 121.8, 119.6, 118.0, 115.4, 111.2, 111.1, 110.7, 83.3, 80.7, 47.8, 46.4, 34.6, 8.4; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 490, 2 974, 1 716, 1 573, 1 533, 1 384, 1 164, 1 028, 847, 574。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)吲哚啉-2-酮(8d),红色固体0.153 g,收率为83%。熔点:231.5~234.1 ℃; HRMS: C₃₃H₃₀ClFN₇O₂, [M+H]⁺: 610.213 0(计算值: 610.213 4); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.21 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.47 (d, J=7.4 Hz, 1H), 8.36 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.20 (d, J=4.8 Hz, 1H), 7.93 (d, J=7.8 Hz, 2H), 7.65 (d, J=3.2 Hz, 1H), 7.55~7.47 (m, 3H), 7.27 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.19 (t, J=7.5 Hz, 1H), 4.15 (brs, 2H), 3.42 (brs, 2H), 3.29 (brs, 4H), 1.22 (t, J=6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.1, 157.7, 156.9, 154.9, 154.3, 152.7, 152.2, 150.0 (d, ¹J_C-F=263 Hz), 149.8, 144.3, 136.3 (d, ⁴J_C-F=1.8 Hz), 133.5, 129.6, 129.4, 128.9, 126.8 (d, ³J_C-F=8.8 Hz), 123.7, 123.3, 123.0, 122.5 (d, ³J_C-F=6.8 Hz), 119.1, 118.9 (d, ²J_C-F=18.4 Hz ), 116.7, 116.6(d, ²J_C-F=21.4 Hz), 115.4, 110.7, 109.6, 47.9, 46.4, 34.5, 8.3; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 456, 2 925, 1 716, 1 608, 1 496, 1 191, 1 031, 810, 752, 549。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8e),红色固体0.152 g,收率为81%。熔点:249.6~252.1 ℃; HRMS: C₃₃H₂₉ClFN₇O₂, [M+H]⁺: 628.203 6 (计算值: 628.203 9); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.12 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.27 (d, J=7.5 Hz, 1H), 8.23 (dd, J=8.2、2.4 Hz, 1H), 8.19 (d, J=4.8 Hz, 1H), 7.90 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.85 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.65 (d, J=3.6 Hz, 1H), 7.47~7.44 (m, 2H), 7.40 (td, J=9.0、2.7 Hz, 1H), 7.28 (dd, J=8.5、4.0 Hz, 1H), 4.13 (t, J=5.3 Hz, 2H), 3.47 (brs, 2H), 3.30 (brs, 4H), 1.23 (t, J=7.1 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.0, 158.3 (d, ¹J_C-F=215.4 Hz), 157.4, 157.2, 154.8, 153.5 (d, ¹J_C-F=242.2 Hz), 153.3, 150.9 (d, ⁴J_C-F=2.2 Hz), 149.8, 149.0, 140.5, 136.2 (d, ⁴J_C-F=2.0 Hz), 129.0, 128.7, 126.7, 123.8 (d, ³J_C-F=7.3 Hz), 123.7, 122.5 (d, ³J_C-F=6.8 Hz), 119.6 (d, ²J_C-F=23.4 Hz), 119.2, 118.8 (d, ²J_C-F=18.1 Hz), 117.3 (d, ³J_C-F=9.2 Hz), 116.5 (d, ²J_C-F=21.5 Hz), 116.4, 115.3, 110.8, 110.6 (d, ³J_C-F=7.4 Hz), 48.6, 46.4, 34.6, 8.4; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 431, 2 979, 1 720, 1 614, 1 498, 1 166, 1 029, 891, 810, 547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8f),红色固体0.152 g,收率为79%。熔点:251.6~252.7 ℃; HRMS: C₃₃H₂₉Cl₂FN₇O₂, [M+H]⁺: 644.173 1 (计算值: 644.174 4); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.05 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.47 (m, 1H), 8.27 (d, J=8.7 Hz, 1H), 8.13 (d, J=4.5 Hz, 1H), 7.84~7.80 (m, 2H), 7.59 (d, J=3.6 Hz, 1H), 7.57 (dd, J=8.5、1.8 Hz, 1H), 7.46 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J=3.6 Hz, 1H), 7.27 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.10 (brs, 2H), 3.49 (brs, 2H), 3.27 (brs, 4H), 1.21 (t, J=6.9 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.8, 157.6, 157.1, 154.9, 154.3, 153.3, 152.7, 149.8 (d, ¹J_C-F=278.3 Hz), 148.9, 142.8, 136.1, 132.5, 129.0, 128.9, 128.6, 127.1, 126.6, 124.2, 124.0, 122.8 (d, ³J_C-F=6.7 Hz), 119.4, 118.8(d, ²J_C-F=18.1 Hz), 117.9, 116.5(d,²J_C-F=21.6 Hz), 115.3, 111.1, 110.6, 47.8, 46.4, 34.7, 8.8; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 525, 2 935, 1 722, 1 608, 1 496, 1 365, 1 031, 804, 630, 547。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)吲哚啉-2-酮(8g),红色固体0.139 g,收率为65%。熔点:174.5~176.9 ℃; HRMS: C₄₀H₃₆ClFN₇O₃, [M+H]⁺: 716.255 6 (计算值: 716.255 2); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.23 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.47 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.36 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.93 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.83 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J=2.8 Hz, 1H), 7.54~7.45 (m, 3H), 7.35~7.31(m, 3H), 7.28 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.19 (t, J=7.0 Hz, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.16 (brs, 2H), 3.41 (d, J=4.3 Hz, 2H), 3.27~3.26(m, 4H), 1.22 (t, J=6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.8, 162.2 (d, ¹J_C-F=243.1 Hz), 157.6, 157.0, 155.0, 152.0, 151.0, 149.9, 149.7, 149.1, 144.7, 139.6 (d, ³J_C-F=7.6 Hz), 133.4, 133.1, 130.5 (d, ³J_C-F=9.1 Hz), 129.6, 129.0, 128.7, 126.6, 124.4, 123.9, 123.3 (d, ⁴J_C-F=1.5 Hz), 123.1, 122.7, 122.1, 121.1, 119.1, 116.5, 115.4, 114.6 (d, ²J_C-F=21.1 Hz), 114.3, 114.0 (d, ²J_C-F=22.6 Hz), 110.5, 109.8, 109.5, 69.4, 48.4, 46.5, 35.9, 9.9; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 654, 2 968,1 714,1 604,1 382, 1 267,1 024,794,750,513。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氟吲哚啉-2-酮(8h),红色固体0.141 g,收率为64%。熔点:196.7~197.3 ℃; HRMS: C₄₀H₃₅ClF₂N₇O₃, [M+H]⁺: 734.246 4 (计算值: 734.245 8); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.00 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.18 (d, J=6.4 Hz, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.83 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.79 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.63 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.52~7.46 (m, 1H), 7.44 (d, J=2.6 Hz, 1H), 7.37~7.32 (m, 3H), 7.28 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.22~7.17 (m, 2H), 5.27 (s, 2H), 3.95 (brs, 2H), 2.99 (brs, 4H), 1.06 (brs, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.7, 162.2 (d, ¹J_C-F=244.6 Hz), 158.8 (d, ¹J_C-F=238.6 Hz), 157.6, 157.2 (d, ³J_C-F=6.0 Hz), 155.1, 153.0, 150.9 (d, ⁴J_C-F=3.0 Hz), 149.9,149.8,149.0,145.8, 141.0, 139.6 (d, ³J_C-F=7.5 Hz), 132.9, 130.5 (d, ³J_C-F=7.5 Hz),128.8, 128.7, 126.5, 124.4, 124.1, 123.5, 123.3 (d, ⁴J_C-F=3.0 Hz), 122.6, 122.3, 121.0, 119.5 (d, ²J_C-F=24.2 Hz), 119.2, 116.4 (d, ²J_C-F=25.7 Hz), 115.3, 114.7 (d, ²J_C-F=21.1 Hz), 114.2, 114.0 (d,²J_C-F=21.1 Hz), 110.6 (d, ³J_C-F=9.1 Hz), 69.4, 48.4, 46.5, 36.0, 10.0; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 332, 2 636, 1 710, 1 617, 1 498, 1 417, 1 269, 1 028, 810, 518。

(Z)-1-(2-(二乙氨基乙基))-3-(((E)-(5-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基)喹唑啉-6-基)呋喃-2-基)亚甲基)亚肼基)-5-氯吲哚啉-2-酮(8i),红色固体0.138 g,收率为61%。熔点:199.3~200.9 ℃; HRMS: C₄₀H₃₅Cl₂FN₇O₃, [M+H]⁺: 750.216 6 (计算值: 750.216 2); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.16 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 8.77 (d, J=4.6 Hz, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.52 (d, J=5.4 Hz, 1H), 8.33 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.85 (t, J=8.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.68~7.56 (m, 2H), 7.52~7.42 (m, 2H), 7.33 (dd, J=27.2、8.6 Hz, 4H), 7.20 (t, J=8.3 Hz, 1H), 5.28 (s, 2H), 4.13 (brs, 2H), 3.40 (brs, 2H), 3.28 (brs, 4H), 1.22 (t, J=7.0 Hz, 6H); ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.8, 162.2 (d,¹J_C-F=244.6 Hz), 157.9, 157.1, 154.8, 153.2, 150.7, 150.1, 148.9, 142.9, 139.6 (d,³J_C-F=7.5 Hz), 132.6, 130.5 (d, ³J_C-F=7.5 Hz), 129.0, 127.9, 127.1, 126.7, 125.9, 124.6, 124.3, 123.3 (d, ⁴J_C-F=3 Hz), 122.8, 122.6, 121.1, 119.5, 118.0, 115.2, 114.7 (d, ²J_C-F=21.1 Hz), 114.3, 114.0 (d, ²J_C-F=21.1 Hz), 111.5, 111.2, 110.7, 69.4, 47.8, 46.4, 34.6, 8.3; IR ν_max(KBr) cm^-1: 3 422, 2 640, 1 714, 1 598, 1 382, 1 261, 1 026, 981, 798, 513。

1.2.6 抗肿瘤活性实验

利用MTT法测定化合物8a~8i对肿瘤细胞的生长抑制活性。取对数期生长状态良好的人肿瘤细胞SW480、A431、NCI-H1975和A549,用0.25%的胰酶消化液消化细胞,离心收集,重悬计数后,制备成细胞悬液,并调整细胞悬液浓度为2×10⁴~5×10⁴个/mL。随后将细胞悬液接种于96孔细胞培养板(100 μL/孔),并将其置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24 h。用培养基将受试化合物稀释至相应浓度,并将其加入上述已接种人肿瘤细胞的96孔细胞培养板中(100 μL/孔),调整二甲基亚砜(DMSO)的最终体积分数为0.5%,随后将培养板置于培养箱中继续培养。72 h后,在培养板中加入噻唑蓝溴化四唑(MTT,20 μL/孔),混匀后,继续在培养箱中反应。4 h后取出培养板,弃去孔内上清液,加入DMSO(150 μL/孔),将培养板置于摇床上震荡10 min。待充分溶解甲臜后,用多功能酶标仪测定570 nm处的吸光度,同时以630 nm处的吸光度作为参比,计算肿瘤细胞生长抑制率。

(1)肿瘤细胞生长抑制率= 1—[(D_S-D_NC) / (D_PC-D_NC)] × 100%。

其中:D_S为样品孔的吸光度(细胞+待测化合物+MTT);D_NC为调零孔的吸光度(培养基DMSO+MTT);D_PC为对照孔的吸光度(细胞+DMSO+MTT)。

受试化合物对肿瘤细胞生长的抑制曲线采用Graphpad Prism 5软件拟合,得到I_C50值,每组实验均重复3次。

2 结果与讨论

本研究所述的9个N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物8a~8i的合成路线如图2所示。先是由化合物N'-(2-氰基-4-碘苯基)-N,N-二甲基甲脒分别与3种不同的芳胺类化合物2a~2c进行Dimroth重排反应生成3种喹唑啉类化合物3a~3c;所得3a~3c在钯碳的催化下分别与5-甲酰基呋喃-2-硼酸进行Suzuki偶联生成化合物4a~4c。同时,分别通过3种靛红衍生物5a~5c与N,N-二乙氨基氯乙烷盐酸盐之间的亲核取代反应得到靛红1-位接入亲水基团的衍生物6a~6c;而化合物6a~6c与水合肼之间加成消去得到化合物7a~7c。最后,4a~4c分子中的醛基分别与7a~7c分子中的氨基通过先加成再消去反应生成目标产物8a~8i。

2.1 化合物6a~6c的合成

化合物6a~6c的制备参考文献[23-24]的方法,以5-取代靛红和N,N-二乙氨基氯乙烷盐酸盐为原料通过亲核取代反应合成。分别对碱的种类、反应溶剂、反应温度、反应时间进行优化,结果列于表1。结果表明:1)由实验1、2可知,当其他条件一定,V_氯仿∶V_水=1∶1.8时,改变反应温度与反应时间对产率的影响较小。2)由实验3、4可知,当其他条件一定,V_氯仿∶V_水=1∶0.9时,室温反应10 h,产率明显提高。3)由实验4、5可知,以NaH作碱、DMF作反应溶剂,后处理中会有大部分产物溶在DMF中,产率较低;而以K₂CO₃作碱、氯仿-水作溶剂,后处理用氯仿萃取,产率较高。

表1 合成1-(2-二乙氨基乙基)-1-氢-吲哚-2,3-二酮的条件优化

Tab.1 The synthesis condition optimization of 1-(2-(diethylamino)ethyl)-1-H-indoline-2,3-dione

实验号	碱	反应溶剂	反应温度	反应时间/h	产率/%
实验1	K₂CO₃	V_氯仿∶V_水=1∶1.8	40 ℃	4	17
实验2	K₂CO₃	V_氯仿∶V_水=1∶1.8	室温	10	21
实验3	K₂CO₃	V_氯仿∶V_水=1∶0.9	40 ℃	4	21
实验4	K₂CO₃	V_氯仿∶V_水=1∶0.9	室温	10	63
实验5	NaH	DMF	60 ℃	2	42

2.2 目标化合物8a~8i的合成及结构确定

目标化合物8a~8i参考文献[25]的方法,以4-芳氨基-6-(5-甲酰基呋喃-2-基)喹唑啉和(Z)-1-(二乙氨基乙基)-3-腙-5-取代吲哚啉-2-酮为原料,通过先亲核加成再消去反应得到。选择冰乙酸作为催化剂而不用盐酸等强酸,是由于酸给出的氢离子不仅能够和羰基结合,增加羰基的亲电性,也能与氨基结合,使氨基丧失亲核能力。冰乙酸为弱酸,其在使羰基亲电性增加的同时,能够避免胺类化合物过度质子化。选择无水乙醇和DMF作为反应溶剂,后处理只需要旋蒸除去溶剂,用甲醇-四氢呋喃重结晶即可得到目标化合物。该方法操作简单,处理方便。

现以化合物8b为例说明结构表征过程。在化合物8b的¹H NMR谱(图3)中,δ 10.11 (s, 1H)和9.08 (s, 1H)处各出现1个单峰,这是4位芳氨基喹唑啉类化合物的2个特征共振信号,前者是4位芳胺基NH的共振峰,后者为喹唑啉母核2位氢的共振峰。δ 8.77 (s, 1H)处出现的1个单峰为H—C=N的共振峰。δ 8.67 (s, 1H)处出现的1个单峰为喹唑啉母核5位氢的共振峰。δ 8.32 (d, J=8.6 Hz, 1H)和7.90 (d, J=8.6 Hz, 1H)处为喹唑啉母核7、8位2个氢的共振峰。δ 7.68 (d, J=3.5 Hz, 1H)和7.50 (d, J=3.5 Hz, 1H)处为呋喃环2个氢的共振峰。δ 4.21 (s, 1H)处出现的1个单峰为炔基氢的共振峰。δ 4.14 (brs, 2H)处为N,N-二乙氨基乙基上与5-氟靛红1-位N上相连的2个氢的共振峰。δ 3.41 (brs, 2H)处为N,N-二乙氨基乙基上与N相连的2个氢的共振峰。δ 3.29~3.22 (m, 4H)处为N,N-二乙氨基乙基上2个CH₂上4个氢的共振峰。δ 1.22 (t, J=6.7 Hz, 6H)处为N,N-二乙氨基乙基上2个CH₃上6个氢的共振峰。同时,本研究还通过¹³C NMR、IR和HRMS证实了化合物8b是目标化合物。

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图3 化合物8b的¹H NMR谱

Fig.3 The ¹H NMR spectrum of compound 8b

2.3 抗肿瘤活性

以上市的抗肿瘤药物拉帕替尼(Lapatinib)和吉非替尼(Gefitinib)为阳性对照,以SW480、A431、NCI-H1975和A549为受试细胞,用MTT法对合成的目标化合物8a~8i进行抗肿瘤活性测试,结果如表2所示。化合物8a、8b、8e、8g、8h对A431增殖具有明显抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8g对A549和NCI-H1975增殖具有明显抑制作用,化合物8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g对SW480增殖具有明显抑制作用。综上所述,化合物8a、8b、8e、8g对4种受试细胞均表现出良好的增殖抑制作用,优于阳性对照拉帕替尼和吉非替尼。此外,当喹唑啉4-位引入3-乙炔基苯氨基时,抑制肿瘤细胞增殖的活性较好;引入3-氯-4-氟苯氨基和3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯氨基时,抑制肿瘤细胞增殖的活性次之。靛红5-位无取代基或被F取代时,抑制肿瘤细胞增殖的活性较好;被Cl取代时,抑制肿瘤细胞增殖的活性较差。

表2 目标化合物对4种受试肿瘤细胞的体外抑制活性(I_c50)

Tab.2 Inhibitory activities (I_c50) of target compounds against four tested tumor cells in vitro 单位:μmol/L

化合物	SW480	A549	A431	NCI-H1975
拉帕替尼	12.58±1.35	14.90±1.21	4.80±0.71	12.68±0.73
吉非替尼	12.50±0.28	12.50±0.28	4.45±0.25	12.70±2.98
靛红	>100	>100	>100	>100
8a	3.05±1.32	2.82±0.50	3.11±1.08	2.91±0.55
8b	4.97±0.48	2.79±0.40	1.93±0.25	4.42±0.36
8c	5.43±0.37	9.45±0.26	5.77±1.52	5.39±1.63
8d	4.69±1.45	5.18±0.35	6.90±0.76	6.91±0.61
8e	4.70±0.96	4.43±0.77	2.39±0.63	7.85±1.32
8f	9.82±2.05	19.51±1.73	12.39±1.61	13.99±4.21
8g	4.11±0.64	2.10±0.74	1.16±0.04	5.07±2.15
8h	>20	>20	1.55±0.43	>20
8i	>20	>20	6.19±1.74	>20

根据合成化合物的结构及其抗肿瘤活性测试结果,分析出可能存在的构效关系:在喹唑啉4-位引入芳氨基能够增强化合物对表皮生长因子受体HER-2的亲和力,抑制表皮生长因子受体过度表达;且由于与酪氨酸激酶结合的ATP疏水性口袋空间比较大,即使在喹唑啉4-位引入如芳氨基这样较大的基团,也能够通过旋转的方式深入亲脂性口袋与激酶结合。此外,4-芳氨基C3、C4位的取代基与激酶表面非常相近,在4-芳氨基C3、C4位上引入—F、—Cl、—C≡CH这样的小基团可能更有利于化合物与激酶结合^[26]。在靛红1-位引入亲水基团N,N-二乙氨基乙基可以调节化合物的水溶性,且通过与前期实验室抗肿瘤活性数据^[21]的比较,证明引入亲水基团可以提高化合物对肿瘤细胞增殖的抑制活性。综上所述,喹唑啉母核上引入的芳氨基、靛红结构单元和亲水基团协同作用,能够更大程度地发挥喹唑啉类化合物的抗肿瘤作用。

3 结论

本研究在保留上市药物拉帕替尼、吉非替尼和埃罗替尼结构单元的基础上,与具有抗肿瘤活性的靛红结构单元杂合,同时引入亲水基团,经5步反应合成了9个结构新颖的N-取代靛红杂合喹唑啉类化合物。利用NMR、IR和HRMS对反应中间体及目标化合物的结构进行确定,同时以4种人肿瘤细胞为受试细胞,采用MTT法对合成的9个新化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。结果表明,9个化合物均具有一定的肿瘤细胞增殖抑制活性。其中,化合物8a、8b、8e、8g对4种受试细胞均表现出较好的增殖抑制作用,优于阳性对照拉帕替尼和吉非替尼;其合成原料易得,步骤较为简单,路线较为成熟,是具有开发潜力的抗肿瘤化合物。

参考文献

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Abstract

图1 部分抗肿瘤化合物的结构式

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.2 实验方法

图2 目标化合物的合成路线

1.2.1 化合物3a~3c的合成

1.2.2 化合物4a~4c的合成

1.2.3 化合物6a~6c的合成

1.2.4 化合物7a~7c的合成

1.2.5 化合物8a~8i的合成

1.2.6 抗肿瘤活性实验

2 结果与讨论

2.1 化合物6a~6c的合成

表1 合成1-(2-二乙氨基乙基)-1-氢-吲哚-2,3-二酮的条件优化

2.2 目标化合物8a~8i的合成及结构确定

图3 化合物8b的1H NMR谱

2.3 抗肿瘤活性

表2 目标化合物对4种受试肿瘤细胞的体外抑制活性(Ic50)

3 结论

参考文献

图3 化合物8b的¹H NMR谱

表2 目标化合物对4种受试肿瘤细胞的体外抑制活性(I_c50)