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2024 , Vol. 52 >Issue 6: 38 - 47

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024323

偏振光谱成像专题 主持人：任立勇

基于大视场结构光照明的三维层析显微成像技术

  • 温同强 1 ,
  • 陈肖霏 2, 3, 4 ,
  • 温凯 2, 3, 4 ,
  • 郜鹏 , 2, 3, 4, *
展开
  • 1 洛阳职业技术学院 机电工程学院,河南 洛阳 471000
  • 2 西安电子科技大学 物理学院,陕西 西安 710071
  • 3 复杂环境光电感知教育部重点实验室,陕西 西安 710071
  • 4 陕西省高校信息纳米材料工程研究中心,陕西 西安 710071
*郜鹏,男,教授,博士生导师,研究方向为超分辨显微镜。E-mail:

Copy editor: 李博

收稿日期: 2024-08-08

  网络出版日期: 2024-11-25

基金资助

国家重点研发计划(2021YFF0700303)

国家自然科学基金(62075177)

收起

Three dimensional tomographic microscopy based on large-field optical sectioning structured illumination

  • WEN Tongqiang 1 ,
  • CHEN Xiaofei 2, 3, 4 ,
  • WEN Kai 2, 3, 4 ,
  • GAO Peng , 2, 3, 4, *
Expand
  • 1 School of Mechanical and Electronic Engineering,Luoyang Institute of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan, China
  • 2 School of Physics, Xi’dian University, Xi’an 710071, Shaanxi,China
  • 3 Key Laboratory of Optoelectronic Perception of Complex Environment, Ministry of Education, Xi’an 710071, Shaanxi, China
  • 4 Engineering Research Center of Information Nanomaterials, Universities of Shaanxi Province, Xi’an 710071, Shaanxi,China

Received date: 2024-08-08

  Online published: 2024-11-25

Fold

摘要

提出一种大视场结构照明光切片显微(large-field optical sectioning structured illumination microscopy, LF-OS-SIM)技术,以实现对厚样品的三维层析显微成像。该技术利用一维光栅投影生成条纹结构光场,并结合空间光调制器(spatial light modulator, SLM)对结构光的频谱进行快速相移。与传统的结构照明光切片显微技术相比,LF-OS-SIM的成像视场(field of view,FOV)提升至原有的4.7倍。同时,利用空间光调制器(spatial light modulator,SLM)进行数字相移,获得了20 帧/s的切片速度。利用LF-OS-SIM对硬币、三维分布的荧光小球、生物样品进行了三维层析显微成像,结果发现LS-OS-SIM的成像视场达1 030×780 μm2,轴向层析成像精度达4.0±0.39 μm。由于其大视场、高分辨率和快速切片速度的优势,LS-OS-SIM有望在工业微器件和生物样品的三维成像中得到广泛应用。

关键词： 结构光照明; 三维成像; 光学切片; 大视场

本文引用格式

温同强 , 陈肖霏 , 温凯 , 郜鹏 . 基于大视场结构光照明的三维层析显微成像技术[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2024 , 52(6) : 38 -47 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024323

Abstract

This study introduces a technique known as large-field optical sectioning structured illumination microscopy(large-field optical sectioning structured illumination microscopy, LF-OS-SIM) designed for three-dimensional tomographic microscopic imaging of thick specimens. The technique utilizes a one-dimensional grating projection to generate a striped structured light field, in conjunction with a spatial light modulator (spatial light modulator, SLM) for fast phase-shifting of the structured light spectrum. Compared to conventional OS-SIM techniques that are based on SLM/DMD projection, LF-OS-SIM enhances the spatial bandwidth product (spatial bandwidth product, SBP) by 4.7 times. Additionally, digital phase-shifting using the SLM is implemented to achieve a slicing speed of 20 frames per second. The LF-OS-SIM was employed for three-dimensional tomographic microscopic imaging of objects such as coins, three-dimensionally distributed fluorescent beads, and biological specimens. The results indicated that the imaging field of view (FOV) for LS-OS-SIM reached 1 030×780 μm3, with an axial tomographic imaging accuracy of 4.0±0.39 μm. Given its wide field of view, high resolution, and rapid slicing capabilities, LS-OS-SIM is anticipated to be extensively applied in the three dimensional imaging of both industrial microdevices and biological samples.

Key words： structured illumination; 3D imaging; optical sectioning; large field of view

与电子显微镜相比,光学显微镜具有结构简单、对样品损伤小等优点,在探索微观世界的过程中发挥着不可替代的作用。然而,传统的光学显微镜因无差别地记录在焦图像和离焦背景信息,无法获得样品的三维结构。近年来,三维光学显微成像技术快速发展,使得人们可以对细胞、组织和生物个体的三维结构进行观测[1⇓⇓-4]。尤其是借助荧光标记,三维光学显微镜还可以观测生物样本中特定的亚细胞器的三维结构[5-6]。
目前三维光学显微技术主要有:光学投影断层扫描(optical projection tomography, OPT)技术[7⇓-9]、共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)技术[10⇓⇓-13]、多光子显微镜(multiphoton microscopy)[14]、光片荧光显微(light sheet fluorescence microscopy, LSFM)技术[15-16]、结构光照明显微(optical sectioning structured illumination microscopy, OS-SIM)成像技术[17⇓⇓⇓⇓⇓-23]等。其中,OPT技术利用在样品上投影条纹,并利用投影和采集之间的三角关系通过算法重建样本的三维成像;CLSM技术通过扫描聚焦光斑对样品进行逐点成像,并利用针孔抑制除焦点以外的背景荧光信号来获取样品的三维图像;多光子显微镜在CLSM的基础上采用更长波段的激发光源(具有较长的穿透深度),利用荧光标记物的非线性过程(吸收2个或多个光子后辐射荧光分子)来减少背景信号的强度,成为深层组织和活细胞成像的强大工具;LSFM技术利用一个薄光片照亮样品并从垂直角度对样品进行成像从而高速生成样品的三维图像,该方法成像速度快但操作不便(样品空间较小)、轴向切片精度低(照明光片厚度大);OS-SIM 采用正/余弦条纹光场照明样品,当条纹频率足够高时,只有焦平面上的样品部分才能加载条纹。通过条纹相移的方式,可以消除相移期间保持不变的离焦分量,只留下焦平面信息,以此实现对样品的“光切片”操作。最后,通过轴向移动样品或结构光形成3D图像。相比于其他技术,OS-SIM具有更快的成像速度、更低的光毒性及光漂白性[24],因此被广泛地应用于活体生物样品的成像。然而,OS-SIM的视场以及空间带宽积受探测器的像素尺寸和像素数量的限制。例如:传统OS-SIM采用SLM/DMD投影条纹结构光,而市场上商用的SLM/DMD的像素个数一般为1 920×1 080,这便导致OS-SIM仅能产生640个条纹(每个条纹至少需要3个像素以完成相移操作)。在100×/1.4NA的物镜下,条纹的周期为系统分辨率极限的2倍,即380 nm,此时条纹图案最大覆盖视场为243×137 μm2。该成像视场远不能满足病理切片分析对高通量成像的需求。为了提升OS-SIM的成像视场,人们经常通过机械平移样本并对每次采集的图像进行拼接的方法来实现[25-26]。该方法存在采样时间长、机械误差大、图像不连续等问题。此外,清华大学戴琼海院士团队研发了视场大小为1×1.2 mm2、分辨率1.2 μm的大视场显微镜(real-time, ultra-large-scale, imaging at high-resolution marcoscope,RUSH)[27]。然而,该方法造价十分昂贵,暂时无法推广。
针对以上问题,本研究提出一种大视场结构照明光切片显微镜(LF-OS-SIM)技术。该技术利用物理光栅投影克服了传统OS-SIM成像视场小的问题,采用SLM对结构光频谱进行调制克服了基于物理光栅投影传统OS-SIM相移速度慢的问题。此外,采用部分相干照明获得更薄的轴向条纹分布,并优化光栅周期(衍射极限分辨率两倍),以获得更好的光学切片效果。

1 方法

LF-OS-SIM成像装置如图1b所示:系统采用带尾纤输出的532 nm窄带激光器为光源,单模光纤另一端出射的激光经过旋转毛玻璃散射形成部分相干照明光。该照明光的发散角θmax可以通过改变光纤终端与毛玻璃之间的距离进行调整。实验中选取θmax= 0.8 rad,以有效地抑制散斑噪声,并使得OS-SIM具有良好的光切片能力。照明光被透镜L1准直后照明至物理光栅。光栅衍射形成的多个平行光束,经过L2透镜傅里叶变换作用和全内反射(total internal reflection, TIR)棱镜的反射后,照明光的频谱出现在SLM前距离为d的平面上。该离焦距离d保证不同衍射级的频谱能够被足够多的SLM像素所采样,以避免对SLM造成损坏同时提高相移精度。通过SLM调制后,照明光频谱经过由L3和L4镜头组成的4f系统成像到一空间掩膜板上,该掩膜板阻挡除±1级以外的所有衍射阶。选定的±1级衍射光通过L5进行傅里叶变换后形成正弦条纹结构光,之后通过管镜-显微物镜(tube lens-microscope objective,TL-MO)组成的4f系统缩束成像到样品平面上。此外,在光路中还放置了2个线性起偏器P1和P2,其中P2透振方向确保SLM的调制效率最大化,通过旋转P1可以控制照明强度。
图1 LF-OS-SIM的原理和装置示意图

注:网络版为彩图。

Fig.1 The schematic setup of LF-OS-SIM

图1a显示了通过3D扫描放置在样品平面的1个反射镜片获得的结构光图案的xz截面。在结构光照明下,样品发出的荧光沿着激发光的反向光束路径传播。经过二向色镜DM(Di03-R405/488/561/635-t3-50.8-D,Semrock公司,美国)的反射后,形成的荧光图像由sCMOS(6 560×4 948像素,像素尺寸3.2 μm,Basler boA6500-36cm,宝视纳视觉北京有限公司,中国)相机记录。同时,为了获得样本的3D结构,采用LabView控制压电位移台(FOC500,Pizenoconcept,法国)对样品进行轴向扫描,对于轴向每一层都记录3幅相移强度图像,最后利用下文介绍的再现算法可以获得样品的三维图像。实验中,选用了20×/0.75NA的物镜(奥林巴斯,日本),该物镜将系统的空间分辨率显微为0.61λ/NA=396 nm。
在SIM成像系统中,CMOS采集的原始数据的强度分布[28]可以表示为
Idet,m=(S×Iillum,m)⊗h+Nnoise。
式中:Iillum,m(r)=I0[1+m·cos(2πk0r+φm)]是结构光强度分布,I0表示调制光强,m表示调制深度,k0表示空间频率,φm=2π(m-1)/3表示结构光的相移量;S表示样品中荧光标记物的空间分布;⊗表示卷积运算符;h表示点扩散函数(point spread function, PSF);Nnoise表示成像中的背景噪声。将Iillum,m(r)=I0[1+m·cos(2πk0r+φm)]代入到方程(1)可得
Idet,m(r)=Idc+ I O S 1exp[-i2π(m-1)/3]+ I O S - 1exp[i2π(m-1)/3]。
式中:Idc表示Idet,m(r)的DC项,它不会随相移操作而变化; I O S 1和 I O S - 1为被结构光调制的分量。当采用相移量为φm=2π(m-1)/3的三步相移时,采集到的3幅图像的强度分布可以用矩阵形式表示为
1 1 1 1 e x p ( - i 2 π / 3 ) e x p ( i 2 π / 3 ) 1 e x p ( - i 4 π / 3 ) e x p ( i 4 π / 3 ) I d c I O S 1 I O S - 1= I d e t , 1 I d e t , 2 I d e t , 3。
通过解方程(3)可以得到样品的光切片图像IOS(r)为
IOS(r)= 1 3 ∑ m = 1 3 I d e t , m · e x p [ i 2 π ( m - 1 ) / 3 ]。
从方程(3)、(4)可以得出:由于结构光仅存在于轴向很薄的一层,随着结构光的横向移动(相移操作),分布于条纹平面的样品结构被结构光所调制而变成交流分量,处于离焦区域的样品结构则变为直流分量。来自离焦区域的样品结构和背景噪声在相移过程中被去除掉,最终形成了光切片图像[29]。
将3个记录的原始图像相加可获得宽视场图像
IWF(r)= 1 3 ∑ m = 1 3Idet,m。
为了进一步抑制高频噪声,本文通过对公式(4)和(5)进行加权得到光学切片图像IFinal [30]为
I F i n a l ( r ) = F - 1 { α 1 M L o w F ( I O S ) + 　 　 　 α 2 M H i g h F ( I W F ) } , M L o w = e x p [ - ( κ x 2 + κ y 2 ) / 2 σ 2 ] , M H i g h = 1 - e x p [ - ( κ x 2 + κ y 2 ) / 2 σ 2 ] 。
式中:α1=α2=1表示比例因子;F{·}、F-1{·}分别表示傅里叶变换和逆傅里叶变换算子;MLow、MHigh为低通和高通滤波器;κx、κy表示x和y方向的空间频率:σ=396 mm-1(~0.5 κcut-off)与截止频率κcut-off相关。
传统的OS-SIM技术通常使用SLM/DMD等可编程器件进行条纹投影,目前商用的SLM/DMD像素数一般为1 920×1 080或更低,此时能产生的条纹数量被限制为640×360(每个条纹由3个像素所采样完成相移操作)。例如,Wen等[31]利用1 920×1 080像素的DMD产生了384×216个条纹,当条纹周期为600 nm时成像FOV为230×130 μm2。而LF-OS-SIM条纹图案是通过在采样平面上投射物理光栅生成,条纹数仅受sCMOS相机像素数的约束。本实验在20×/0.75NA物镜下采用6 560×4 948像素(像素大小为3.2 μm)的sCMOS相机记录了周期为1 200 nm的874×660个条纹(对应的视场是1 030×780 μm2),该FOV为传统OS-SIM的4.7倍。需要说明的是结构光照明显微镜(SIM)除了实现三维层析显微成像(OS-SIM)的功能外,还具有超分辨显微成像(SR-SIM)能力。OS-SIM仅需要记录单方向结构光照明下的三帧图像便可以重构出该平面对应的光切片图像,而SR-SIM需要记录9幅(3个方向×3步相移)结构光照明下的原始强度图像才能重构出一幅超越衍射极限分辨率的图像。

2 结果分析

2.1 LF-OS-SIM的移相特性

在LF-OS-SIM中采用SLM实现快速相移,需先校准SLM输入图像灰度与特定波长(本研究中波长为532 nm )下输出相位之间的关系。先将SLM分为对称的左右两半,分别覆盖结构光-1阶和+1阶的频谱。SLM的左侧一半设置为恒定的灰度值(0),而另一半则灰度值从0到255依次增加,通过在样品平面上放置反射镜来记录±1阶衍射光形成的干涉图案。最终,使用离轴数字全息重建算法获得±1阶衍射光之间的相位差[32]。实验证明,当输入灰度值0、71和142时可以产生0、1.95和3.93 rad的相位延迟。
图2a为灰度值为0、71和142的相位掩模图;将相位加载到SLM,就可以利用sCMOS记录的3幅相移干涉图像(图2b所示)。为了评估LF-OS-SIM的相移精度,分别提取了图2b中沿着橙色线的强度分布并展示在图2c中。通过对三条曲线进行余弦函数Iillum,m=I0[1+m·cos(2πκ0r+φ)]拟合,获得拟合参数φ=0、1.95、3.93 rad,与理论相移0、2π/3、4π/3相比最大相移误差为0.24 rad。以上结果表明LF-OS-SIM通过利用SLM调制结构光的频谱可以进行高精度相移操作。在OS-SIM中,条纹结构光的周期选为系统衍射极限分辨的两倍λ/NA时,可以获得最优的层析精度[20]。然而,在条纹周期λ/NA附近,层析精度随条纹周期的变化较为缓慢。本实验中我们采用了83线对/mm的物理光栅来产生条纹结构光,物理光栅到样品平面的缩束比为10,因此样品平面上条纹结构光的周期为1.2 μm。该条纹结构光的周期同时兼顾了高层析精度和图像高信噪比。
图2 LF-OS-SIM 中基于SLM的相移机制

注:网络版为彩图。

Fig.2 SLM-based phase-shifting mechanism in LF-OS-SIM

2.2 LF-OS-SIM 横向和轴向分辨率的表征

本实验通过对盖玻片上荧光颗粒的三维成像来表征LF-OS-SIM的横向和轴向分辨率。首先将直径为240 nm的荧光微球(激发波长532 nm,发射波长580 nm)固定在盖玻片上作为样品;并将此时的平面设置为z=0 μm的基准平面,接着以0.5 μm的增量在[0,30] μm的轴向范围内逐层扫描样品以实现三维成像。根据阿贝衍射极限理论[33],LF-OS-SIM横向分辨率的理论衍射极限为0.5λem/NA=387 nm、轴向分辨率为2λem/NA2=2 062 nm。
为了获得最佳的光学切片效果,将照明条纹的周期设置为成像系统衍射极限分辨率的两倍,即λexc/NA=651 nm。在实验中使用80线对/mm光栅产生的条纹结构光的空间频率为1/1 099 nm-1。图3a、3b分别显示荧光微球的宽视场(wide field of view, WF)和LF-OS-SIM图像。对比图3a中右上角放大显示部分(白色虚框位置)表明LF-OS-SIM图像能有效地抑制失焦背景。图3b展示了沿着图3a中的白色虚线位置的xz剖面图(左侧为WF图像,右侧为LF-OS-SIM图像),LF-OS-SIM图像中的荧光微球图像及背景更清晰。图3c展示了WF和LF-OS-SIM图像通过荧光微球中心的强度分布,通过对强度曲线进行高斯拟合,其半高宽(full width at half maximum,FWHM)作为系统空间分辨率。图3d对10个小球的统计结果表明:WF和LF-OS-SIM的横向FWHM分别为789±33 nm和707±44 nm,轴向FWHM分别为4.9±0.17 μm和4.0±0.39 μm。需要说明的是LF-OS-SIM实验测得的横向和轴向分辨率均大于理论值,这主要是因为系统中存在畸变。
图3 固定在盖玻片上的荧光颗粒的WF和LF-OS-SIM模式分析

注:c图中黑线为WF模式,红线为LF-OS-STM模式,网络版为彩图。

Fig.3 WF and LF-OS-SIM images of fluorescent particles immobilized on a coverslip

此外,通过对WF和LF-OS-SIM中10个荧光微球的信背比(signal to backgroud ratio,SBR)统计(图3e),发现WF和LF-OS-SIM的SBR分别为3.1±0.28和35.3±3.87,即LF-OS-SIM将SBR提高了10倍以上。
为进一步分析LF-OS-SIM的光切片三维成像性能,对琼脂糖凝胶中的荧光微球进行成像。图4a和图4b显示样品在WF和LF-OS-SIM模式下的三维图像和侧视图,通过对比可以发现LF-OS-SIM图像中荧光微球更清晰,背景噪声更低。进一步定量分析表明:WF和LF-OS-SIM图像的SBR分别为1.3±0.10和4.9±0.13,进一步证明LF-OS-SIM具备良好的光学切片能力。
图4 LF-OS-SIM对琼脂中内嵌荧光微球的3D成像结果

注:网络版为彩图。

Fig.4 The imaging results of the 3D agarose fluorescent microspheres by LF-OS-SIM

2.3 LF-OS-SIM对非荧光样品的三维成像

在本实验中,采用LF-OS-SIM对2017年发行的1欧元硬币进行了3D成像测试。该实验中,LF-OS-SIM配备了低倍率物镜(20×/0.75NA)和Basler公司的sCMOS相机来记录强度图像。此时,LF-OS-SIM的成像视场(FOV)为1 030×780 μm2。通过压电位移台沿轴向以1 μm的增量在[0,300]μm的轴向范围内对样品进行扫描,并对每个轴向位置依次记录样品在相移量为0、2π/3和4π/3的结构光照明下的3幅原始图像。然后利用公式(5)、(6)计算出样品的WF与LF-OS-SIM图像。
图5a比较了WF和LF-OS-SIM彩色编码的三维图像,图5b展示了3个轴向切片的宽场和LF-OS-SIM图像。与传统宽场成像相比,LF-OS-SIM具有良好的层析成像能力。图5c显示了图5a中样品在两个成像模式下沿着白色虚线的yz截面强度分布,图5d显示沿图5b中蓝色和黄色虚线的强度分布。实验证明,WF图像因散焦背景的存在丧失三维成像能力,难以区分样品的不同轴向平面的结构分布。相比之下,LF-OS-SIM通过移动条纹结构光,具有轴向切片能力,OS-SIM图像在yz平面内展现了锐利的样品结构,表现出其具有良好的光学切片能力。以上实验表明该LF-OS-SIM有望用于工业中微型器件(例如MEMS)的三维形貌检测。
图5 LF-OS-SIM和宽场显微对欧元硬币的成像对比

注:网络版为彩图。

Fig.5 Comparison of widefield and LF-OS-SIM imaging of a European coin

2.4 LF-OS-SIM对荧光标记生物样品的三维成像

为了分析LF-OS-SIM对荧光标记的生物样品的成像效果。利用LF-OS-SIM对小鼠干细胞中的微管结构进行了三维成像。实验中采用一抗(β-微管蛋白抗体#2146在兔中产生)和二抗(山羊抗兔IgG(H+L)-Alexa Fluor 488)的微管结构进行荧光标记。图6显示了不同深度的微管蛋白在WF和LF-OS-SIM模式下的成像结果。图6a和图6b分别显示样品在z为5.5、6.0、6.7 μm不同平面内微管蛋白的WF和LF-OS-SIM成像。为了便于比较,将图6a中橙色框图像进行放大并展示在图6c中,通过比较z为4.8、5.4、6、6.6和7.2 μm 5个平面内的WF和LF-OS-SIM图像,结果表明LF-OS-SIM在抑制背景噪声和三维切片方面具有显著优势。
图6 固定小鼠干细胞中微管在局部视野中的WF和LF-OS-SIM图像

注:网络版为彩图。

Fig.6 WF and LF-OS-SIM images of microtubules in fixed mouse stem cells in a localized field of view

最后,利用LF-OS-SIM对斑马鱼中肌动蛋白进行了三维成像。图7a和图7b展示了斑马鱼尾部肌动蛋白的WF和LF-OS-SIM图像。对比结果表明LF-OS-SIM可以有效抑制厚生物样品成像中的离焦背景,最终提供清晰的三维图像。以上两个实验均表明LF-OS-SIM有望用于生物样品的快速三维成像。
图7 斑马鱼中肌动蛋白在局部视野中的WF和LF-OS-SIM图像

注:网络版为彩图。

Fig.7 WF and LF-OS-SIM images of actin in a zebrafish (a partial area displayed)

3 结论

本文提出一种大视场光学切片结构照明显微镜(LF-OS-SIM)技术。该技术利用物理光栅投影克服了传统OS-SIM成像视场小的问题,采用SLM对结构光频谱进行调制克服了基于物理光栅投影传统OS-SIM相移速度慢的问题。LF-OS-SIM具有以下特点:
1)LF-OS-SIM的成像视场大。传统OS-SIM使用SLM或数字显微镜(digital micromirror device,DMD)数字投影设备,所能产生的条纹个数≤500个,而LF-OS-SIM采用物理光栅投影,其条纹数仅受限于sCMOS相机像素数。本实验采用6 560×4 948像素的sCMOS相机记录了874×660个条纹(对应的视场是1 030×780 μm2)。
2)LF-OS-SIM的相移速度快。LF-OS-SIM技术采用SLM进行移相,实验中采用SLM的帧频为60帧/s(比CMOS图像采集最大帧频低),实验中需要记录3幅相移结构光照明下的强度图像才能重构一帧光切片图像,因此LS-OS-SIM的切片成像获取速度为20帧/s。
3)解决了像素化采样问题。LF-OS-SIM技术采用物理光栅投影代替SLM/DMD投影,克服了SLM/DMD固有的像素化采样问题(如像素混叠问题),解决了照明功率利用效率低、照明模式中有锯齿状边缘的情况。
在接下来的研究工作中,将继续优化LF-OS-SIM中照明光的空间相干性以获得更高的信噪比和层析精度,开展多色LF-OS-SIM成像研究,进一步推进LF-OS-SIM技术在工业检测和生物成像中的应用。

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