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2024 , Vol. 52 >Issue 5: 97 - 112

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024231

功能化合物应用研究

银杏叶粉对安格斯牛生长性能、血液指标和瘤胃微生物的影响

  • 潘金海 1 ,
  • 马建强 1 ,
  • 孙小磊 2 ,
  • 张涛平 3 ,
  • 昝林森 1, 2 ,
  • 王洪宝 , 1, 2, *
展开
  • 1 西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨陵 712100
  • 2 国家肉牛改良中心,陕西 杨陵 712100
  • 3 陕西秦宝牧业股份有限公司,陕西 杨陵 712100
*王洪宝,男,副教授,博士生导师,研究方向为肉牛遗传改良。E-mail:

Copy editor: 焦阳

收稿日期: 2024-03-03

  网络出版日期: 2024-09-27

基金资助

陕西省重点研发计划(2022GD-TSLD-46-0104)

杨凌示范区青年育种专家培育支持计划

2023年陕西省畜禽种业发展项目

收起

Effects of Ginkgo biloba powder on growth performance, serum indexes and rumen microbiome of Angus cattle

  • PAN Jinhai 1 ,
  • MA Jianqiang 1 ,
  • SUN Xiaolei 2 ,
  • ZHANG Taoping 3 ,
  • ZAN Linsen 1, 2 ,
  • WANG Hongbao , 1, 2, *
Expand
  • 1 College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China
  • 2 National Beef Cattle Improvement Center, Yangling 712100, Shaanxi, China
  • 3 Shaanxi Qinbao Animal Husbandry Co., Ltd, Yangling 712100, Shaanxi, China

Received date: 2024-03-03

  Online published: 2024-09-27

Fold

摘要

为探究银杏叶粉对安格斯牛生长性能、血液指标、瘤胃微生物区系和瘤胃液代谢组的影响,选取25头12~16月龄平均体重453.8 kg的健康安格斯牛,随机分成5组,分别饲喂基础日粮(Con, n=5)及3%(G3, n=5)、6%(G6, n=5)、9%(G9, n=5)和 12%(G12, n=5)的银杏叶粉日粮,预试期 10 d,正试期75 d。结果显示: 日粮中添加银杏叶粉对安格斯牛的平均日增重有一定提升,显著提高了安格斯牛的干物质采食量。与Con组相比,G9组的血清甘油三酯含量显著降低,而总抗氧化能力显著提高,G6和G9组的丙二醛含量显著降低、丙酸比例显著提高、乙酸比例显著降低。各组间瘤胃微生物群落多样性和丰富度无显著差异。在门水平上,与Con组相比,G6和G9组安格斯牛瘤胃中厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度显著提高,而螺旋菌门(Spirochaetota)的相对丰度显著降低;在属水平上,与Con组相比,G6组未分类的F082科和Paludibacter科的相对丰度显著降低,G9 组未分类的 F082科的相对丰度显著降低, 瘤胃琥珀酸菌属(Succiniclasticum)的相对丰度显著升高。瘤胃代谢组结果显示,在正离子模式下,与Con组相比,G6、G9组的瘤胃中脂肪酸含量显著降低,其他代谢物含量显著升高;在负离子模式下,与Con组相比,G6、G9组的瘤胃中二嗪和有机氧化合物的含量显著降低,其他代谢物含量显著升高。综上所述,日粮中添加 6%~9%的银杏叶粉对安格斯牛的生长性能和血液指标都有积极作用,改善了瘤胃发酵参数,并对瘤胃代谢物的组成也具有一定影响,建议银杏叶粉的最适添加量为基础日粮的6%~9%。

关键词： 银杏叶粉; 安格斯牛; 生长性能; 血液指标; 瘤胃微生物; 瘤胃代谢组

本文引用格式

潘金海 , 马建强 , 孙小磊 , 张涛平 , 昝林森 , 王洪宝 . 银杏叶粉对安格斯牛生长性能、血液指标和瘤胃微生物的影响[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2024 , 52(5) : 97 -112 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024231

Abstract

The aim of this study was to investigate the effects of Ginkgo biloba powder on growth performance, serum indexes, rumen microbiome and rumen metabolomics of Angus cattle. A total of 25 healthy Angus cattle with an average body weight of 453.8 kg aged 12~16 months were randomly divided into 5 groups. The cattle were fed the basal diet (Con, n=5) and diets containing 3% (G3, n=5), 6% (G6, n=5), 9% (G9, n=5) and 12% (G12, n=5) Ginkgo biloba powder, respectively. The pre-test lasted for 10 d and the trial lasted for 75 d. The results showed as follows: dietary Ginkgo biloba powder increased the average daily gain of Angus cattle, and significantly increased the dry matter intake of Angus cattle. Compared with Con group, serum triglyceride content in G9 group was significantly decreased,total antioxidant capacity was significantly increased,malonaldehyde concentrations in G6 and G9 groups were significantly decreased. Compared with Con group, the proportions of propionic acid in G6 and G9 groups were significantly increased, while the proportions of acetic acid were significantly decreased. There was no significant difference in the diversity and richness of rumen microbial communities among all groups. At the phylum level, compared with Con group, the relative abundances of Firmicutes in rumen of Angus cattle in G6 and G9 groups were significantly increased, while the relative abundances of Spirochaetota were significantly decreased. At the genus level, the relative abundances of F082_unclassified and Paludibacter_unclassified in G6 group were significantly decreased compared with Con group.The relative abundance of F082_unclassified in G9 group was significantly decreased, and that of Succiniclasticum was significantly increased. The results of rumen metabolomics showed that in positive ion mode, compared with Con group, the contents of fatty acids in the rumen of G6 and G9 groups were significantly decreased, and the contents of other metabolites were significantly increased. In negative ion mode, the contents of diazine and organic oxygen compounds in rumen of G6 and G9 groups were significantly decreased compared with Con group, while the contents of other metabolites were significantly increased. In conclusion, dietary supplementation of 6%~9% Ginkgo biloba powder has positive effects on the growth performance and blood indexes of Angus cattle, improves rumen fermentation parameters, and has certain effects on the composition of rumen metabolites. It is suggested that the optimal supplemental amount of Ginkgo biloba powder should be 6%~9% of the basal diet.

Key words： Ginkgo biloba powder; Angus cattle; growth performance; serum index; rumen microbiome; rumen metabolomics

随着经济的发展和居民消费水平的提高,人们对于肉类的需求量越来越高。如今,农耕土地面积减少导致了饲料资源短缺,从而影响了畜牧产业的发展。如何提高畜禽饲料利用率成为目前畜禽养殖的一大问题。虽然饲料中添加抗生素可以提高动物的生产性能[1],但大剂量抗生素会导致耐药菌株出现,对人类和动物的健康产生威胁[2-3]。因此,开发生物添加剂作为抗生素的替代品成为当下的研究热点[4]。先前大量研究表明,中草药不仅具有预防和治疗动物疾病的功效,还可以改善动物生产性能、增强机体免疫力[5]。Liu等[6]在日粮中添加桑叶黄酮提高了育肥猪的日增重并降低了料重比;An等[7]研究发现生姜提取物可以提高鸡血清中溶菌酶的活性,增强其免疫力。
银杏(Ginkgo biloba)是银杏属多年生乔木,具有非常强的生存能力,中国是银杏的主要产地。银杏叶作为一种中草药,具有抑菌、杀菌、调节血脂、提高免疫力和改善畜禽肠道健康等作用[8-9]。目前,已有多种化学成分从银杏叶中提取分离并被证实,其中银杏黄酮和银杏内酯是银杏叶所特有的活性成分,具有非常高的研究价值[10]。据报道,银杏黄酮可以改善血管内皮细胞的炎症[11];银杏内酯B在银杏内酯中活性最强,对治疗脑缺血作用显著[12]。
瘤胃是反刍动物体内非常重要的消化代谢器官,其内栖息着复杂的微生物群落,包括细菌、真菌和原生生物[13]。瘤胃微生物能够将进入瘤胃中的难以消化的粗纤维和木质素等降解为挥发性脂肪酸,进而被机体吸收和利用[14]。Chen等[15] 发现在海门白山羊的日粮中添加 6%~24%的银杏叶残渣可以显著提高海门白山羊的生长性能,降低饲料成本,增强海门白山羊的抗氧化性能,改善瘤胃发酵和肉质性状,增强动物机体免疫力。Oh等[16]将银杏叶提取物应用于体外瘤胃培养实验,并评估其在不同精粗比(1∶9,3∶7,5∶5,7∶3和9∶1)条件下作为反刍动物饲料添加剂的潜力,发现日粮精粗比为5∶5可以显著降低瘤胃中甲烷的产量。
目前,银杏叶及其提取物在反刍动物中的研究主要集中在生产性能和血液指标方面,但在瘤胃微生物区系和瘤胃代谢组方面还鲜有报道。本研究以银杏叶粉为研究对象,以安格斯母牛为实验动物,开展育肥实验,研究日粮中银杏叶粉比例对安格斯牛生长性能、血液指标、瘤胃微生物区系以及瘤胃液代谢组的影响,以期为银杏叶粉在基础日粮中的合理应用提供科学依据,为开发肉牛绿色纯天然功能性饲料添加剂提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用银杏叶粉购自陕西杨凌富仕特生物科技有限公司。银杏叶粉以天然银杏叶为原料,经过干燥粉碎加工而成。银杏叶粉的干物质含量为95%,粗蛋白含量为18.12%(干物质基础)。

1.2 动物饲养及常规设计

实验在陕西秦宝牧业股份有限公司开展。选用25头12~16月龄健康且体况良好的安格斯母牛为实验动物,随机分为5组,每组5头,于每日9:00和16:00饲喂2次,期间保持自由饮水。对照组(Con)饲喂基础日粮,4个实验组在基础日粮中分别添加 3%(G3)、6%(G6)、9%(G9)和12%(G12)的银杏叶粉,各组间饲粮营养水平基本一致。基础日粮参照《肉牛饲养标准》450 kg体重的生长育肥牛每日增重1 kg所需要的营养标准制定[17],日粮组成及营养水平见表1。实验前对圈舍进行消毒,对牛只进行驱虫处理,实验期为85 d,其中预试期 10 d,正试期75 d。
表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

成分 组 别
Con G3 G6 G9 G12
玉米青贮 67.60 64.60 62.20 58.40 57.30
小麦秸秆 10.00 10.08 9.80 9.60 9.47
玉米 8.18 9.18 9.58 9.98 10.31
豆粕 6.32 5.34 4.72 4.42 5.16
菜粕 2.42 2.92 2.82 2.22 0.88
银杏叶粉 0.00 3.00 6.00 9.00 12.00
小麦麸 2.48 1.88 1.88 3.38 1.88
食盐 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
磷酸氢钙 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
预混料 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
代谢能 10.08 10.07 10.06 10.06 10.06
粗蛋白 11.16 11.13 11.11 11.18 11.13
粗脂肪 3.46 3.33 3.21 3.09 2.97
灰分 4.46 4.65 4.84 5.04 5.21
中性洗涤纤维 40.13 40.33 40.59 40.82 41.02
酸性洗涤纤维 24.07 24.17 24.20 24.05 24.17
钙 0.54 0.53 0.52 0.51 0.50
磷 0.51 0.50 0.49 0.49 0.46

注:每千克预混料提供维生素A 100 kIU,维生素D 80 kIU,维生素E 500 IU,Fe 760 mg,Zn 500 mg,Cu 200 mg,Mn 280 mg。代谢能单位为MJ/kg,其他单位为%。

1.3 样品采集及指标测定

1.3.1 生长性能

于正式实验第1天和第75天早晨测量空腹牛只体重,计算其平均日增重。每天根据前一天安格斯牛的采食量进行日粮的称重和饲喂,保证当天剩料量在3%~5%,并计算干物质采食量和料重比。

1.3.2 表观消化率

采用四分法在实验结束的最后3 d收集各组的饲喂样和剩料样各100 g,称重后于65 ℃烘箱中烘干72 h,计算含水量。室温粉碎后过40目筛,密封保存,用于测定日粮的粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。
在实验结束前3 d,采用全收粪法记录每头实验牛的排粪量,并收集粪便样品带回实验室。粪便样品在65 ℃条件下烘干72 h,测定粪便含水量。室温粉碎过40目筛,密封保存,用于测定粪便中粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的含量。
采用《饲料分析及饲料质量检测技术》[18]中的方法测定安格斯牛营养物质的表观消化率。

1.3.3 血液采集

在正式实验的最后1 d,于晨饲前利用静脉采血采集所有实验牛只的血液,室温静置后,在4 ℃、3 500 r/min条件下离心10 min得到血清,放于-20 ℃冰箱,用于检测血清生化指标和血清抗氧化指标。

1.3.4 瘤胃液采集

在正式实验的最后1 d,于晨饲后2 h通过口腔插入胃管采集瘤胃液50 mL,用四层纱布过滤后,于-80 ℃保存,用于后续瘤胃微生物区系以及代谢组的测定和分析。

1.3.5 血清生化指标和血清抗氧化指标的测定

测定的血清生化指标包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)和钙离子(Ca2+),采用全自动生化分析仪(BK-400,山东博科生物产业有限公司)测定。测定的血清抗氧化指标包括总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),使用试剂盒测定,试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3.6 瘤胃液pH值、氨态氮及挥发性脂肪酸测定

使用pH测定仪测定瘤胃液的pH值,瘤胃液氨态氮的浓度按照屯妮萨·麦提赛伊迪等的方法测定[19],瘤胃液挥发性脂肪酸采用气相色谱仪(6850,安捷伦科技有限公司)检测。

1.3.7 瘤胃液总菌DNA的提取及16S rRNA测序

用十六烷基三甲基溴化铵法提取瘤胃液样品的基因组DNA,之后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,取适量的样品加入到离心管中,并用无菌水稀释至1 ng/μL。用341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')引物对V3+V4可变区进行PCR扩增,PCR反应程序为:98 ℃预变性1 min;30个循环(98 ℃,10 s;50 ℃,30 s;72 ℃,30 s);72 ℃延伸5 min。用2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,根据电泳检测出的PCR 产物浓度进行等浓度混样,充分混匀后使用1×TAE质量浓度2%的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR 产物,切割目的条带并进行胶回收。产物纯化试剂盒使用Qiagen胶回收试剂盒(Qiagen 公司),使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒(Illumina, USA)进行文库构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测,合格后,使用Illumina PE250进行上机测序。后续测序工作由深圳微科盟科技有限公司完成。

1.3.8 瘤胃液代谢组学分析

取200 μL瘤胃液样本于离心管中,6 000 r/min室温离心15 min,取上清液,用一次性0.22 μm无菌滤膜过滤,收集滤液。
瘤胃液的代谢物分析由深圳微科盟科技有限公司采用LC-MS分析来完成。样品在Thermo VanquishTMUHPLC超高效液相色谱系统和Thermo Q ExactiveTM HF-X高分辨质谱平台上进行分析。
色谱条件为: HypersilGoldcolumn(C18) 色谱柱,柱温40 ℃,流速0.2 mL/min,正模式下流动相A为0.1%甲酸,流动相B为甲醇,负模式下流动相A为5 mmol/L醋酸铵,pH 9.0,流动相B为甲醇。
质谱条件为:扫描范围100~1 500 m/z,ESI源喷雾电压3.5 kV,鞘气流速35 psi,辅助气流速10 L/min,离子传输管温度320 ℃,离子导入射频电平60,辅助气加热器温度350 ℃,极性为正、负,MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2019对所得数据初步整理,使用IBM SPSS 27.0进行单因素方差分析(ANOVA),用Duncan法进行多重比较分析,P<0.05代表差异显著。
16S测序数据和代谢组数据均在微科盟生科云平台(https://www.bioincloud.tech/)进行分析。利用QIIME 2.0软件包,对测序片段进行ASV聚类,将ASV代表序列与silva数据库进行比对分析,获取相应的丰度信息。利用QIIME2 core-diversity插件计算α多样性指数。β多样性指数用PCoA图进行展示。应用Kruskal Wallis对分组和样本间差异的微生物菌属进行筛选,并用PICRUSt 软件预测微生物群体可能的功能组成,通过KEGG数据库将微生物的代谢基因匹配到相应的代谢通路中。代谢组数据需对样本数据进行QC质控以及批次校正样本,进行数据的标准化,基于R语言MetaboAnalystR包进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),并根据VIP>1和P<0.05对代谢物进行筛选,整理出显著差异的代谢物,并对差异代谢物进行KEGG通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 银杏叶粉对安格斯牛生长性能的影响

由表2可知,安格斯牛各组间的初重没有显著差异。与Con组相比,G6与G9组的末重略微提高,但差异不显著。G3、G6、G9和G12组的平均日增重与Con组相比均有所提高,但差异不显著。G3、G6、G9和G12组的干物质采食量显著高于Con组(P<0.05),但各组间的料重比没有显著差异。
表2 银杏叶粉对安格斯牛生长性能的影响

Tab.2 Effect of Ginkgo biloba powder on the growth performance of Angus cattle

指标 组 别 标准
误差		 P值
Con G3 G6 G9 G12
初重/kg 459.00 449.25 454.50 452.20 447.25 4.39 0.96
末重/kg 539.80 539.50 546.60 548.80 538.00 4.55 0.96
平均日增重/(kg·d-1) 1.14 1.22 1.25 1.27 1.22 0.26 0.09
干物质采食量/(kg·d-1) 10.51b 11.52a 11.68a 12.23a 11.60a 0.14 0.02
料重比 9.34 9.57 9.27 9.61 9.34 0.19 0.92

注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 银杏叶粉对安格斯牛表观消化率的影响

表3展示了银杏叶粉对安格斯牛表观消化率的影响。可以看出,日粮中添加6%和9%的银杏叶粉可以显著提高安格斯牛粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率(P<0.05)。各组间的干物质消化率和粗脂肪消化率无显著差异。
表3 银杏叶粉对安格斯牛表观消化率的影响

Tab.3 Effect of Ginkgo biloba powder on the apparent digestibility of Angus cattle

指标 组 别 标准
误差		 P值
Con G3 G6 G9 G12
干物质消化率/% 73.56 75.02 75.92 76.42 75.36 0.72 0.80
粗蛋白消化率/% 70.88b 73.34ab 78.97a 78.28a 75.11ab 0.87 0.03
粗脂肪消化率/% 58.30 60.38 63.13 64.96 65.09 1.01 0.13
中性洗涤纤维消化率/% 56.06c 58.84bc 63.16ab 66.12a 60.12abc 0.93 0.01
酸性洗涤纤维消化率/% 36.27b 42.83ab 45.44a 48.60a 48.21a 1.20 0.04

注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 银杏叶粉对安格斯牛血清生化指标和抗氧化指标的影响

银杏叶粉对安格斯牛血清生化指标的影响见表4。由表可知,G9和G12组的血清甘油三酯含量与Con组相比显著降低(P<0.05),G9组的血清Ca2+含量显著高于G12组(P<0.05),但与其他组之间差异不显著。其他血清生化指标无显著差异。
表4 银杏叶粉对安格斯牛血清生化指标的影响

Tab.4 Effect of Ginkgo biloba powder on serum biochemical indexes of Angus cattle

指标 组 别 标准
误差		 P值
Con G3 G6 G9 G12
总蛋白/ (g·L-1) 74.80 71.53 75.35 77.10 72.25 1.38 0.74
白蛋白/ (g·L-1) 28.48 29.00 29.15 30.33 28.35 0.42 0.64
谷丙转氨酶/(U·L-1) 29.50 32.15 32.48 36.88 33.85 1.06 0.28
谷草转氨酶/(U·L-1) 84.48 81.88 76.50 81.43 81.50 2.16 0.87
总胆固醇/(mmol·L-1) 4.19 3.67 3.49 3.48 3.34 0.51 0.13
葡萄糖/(mmol·L-1) 3.54 4.03 3.83 3.78 3.55 0.09 0.43
甘油三酯/(mmol·L-1) 0.28a 0.25ab 0.24ab 0.20b 0.21b 0.01 0.04
尿素氮/(mmol·L-1) 6.28 5.94 6.85 6.13 6.50 0.29 0.91
Ca2+/(mmol·L-1) 2.52ab 2.52ab 2.57ab 2.68a 2.39b 0.03 0.04

注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表5为银杏叶粉对安格斯牛血清抗氧化指标的影响。由表5可知,G9组的血清总抗氧化能力显著高于Con组(P<0.05),G6、G9和G12组的丙二醛含量显著低于Con组(P<0.05)。各组间血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性差异不显著(P>0.05)。
表5 银杏叶粉对安格斯牛血清抗氧化指标的影响

Tab.5 Effect of Ginkgo biloba powder on serum antioxidant indexes of Angus cattle

指标 组 别 标准
误差		 P值
Con G3 G6 G9 G12
总抗氧化能力/ (μmol·mL-1) 7.70b 8.62ab 8.96ab 9.50a 7.94b 0.22 0.03
谷胱甘肽过氧化物酶/ (U·mL-1) 97.44 114.73 117.92 105.03 96.32 3.07 0.06
超氧化物歧化酶/ (U·mL-1) 125.00 137.25 138.25 141.50 133.25 3.18 0.57
丙二醛/ (μmol·L-1) 6.56a 6.31a 5.09b 5.38b 5.65b 0.15 <0.01

注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃发酵参数的影响

由表6可知,各组的瘤胃pH值、氨态氮质量浓度、总挥发性脂肪酸物质的量浓度及异丁酸、异戊酸、戊酸百分比差异不显著。与Con组相比,G3、G6和G9组的乙酸百分比显著降低(P<0.05)。G6和G9组的丙酸百分比显著高于Con组(P<0.05),G3组的丁酸百分比显著高于Con组(P<0.05)。
表6 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃发酵参数的影响

Tab.6 Effect of Ginkgo biloba powder on rumen fermentation parameters of Angus cattle

参数 组 别 标准
误差		 P值
Con G3 G6 G9 G12
pH值 6.88 6.93 7.14 7.05 6.93 0.38 0.44
氨态氮/(mg·dL-1) 11.20 10.89 10.81 10.04 10.69 0.16 0.29
总挥发性脂肪酸/(mmol·L-1) 70.20 67.36 66.19 67.48 68.39 0.53 0.22
乙酸/% 67.83a 65.61c 64.44c 65.86bc 67.35ab 0.34 <0.01
丙酸/% 17.99c 18.56c 21.71a 20.08b 18.78c 0.31 <0.01
异丁酸/% 1.16 1.11 0.98 1.08 1.02 0.05 0.53
丁酸/% 8.10b 10.12a 8.29b 8.34b 8.61b 0.21 <0.01
异戊酸/% 3.20 2.98 2.78 2.82 2.67 0.07 0.15
戊酸/% 1.71 1.64 1.80 1.81 1.56 0.03 0.09

注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃菌群丰富度和多样性的影响

如图1所示,与Con组相比,处理组的瘤胃菌群丰富度指数Chao1和多样性指数Shannon、Simpson、Faith_pd均无显著差异。此外,主坐标分析结果显示(图2), Con组与处理组微生物菌群也没有明显差异,说明各组之间的微生物菌群相似。
图1 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃细菌多样性的影响

Fig.1 Effect of Ginkgo biloba powder on bacterial diversity in rumen of Angus cattle

图2 瘤胃细菌主坐标分析图

注:网络版为彩图。

Fig.2 PCA diagram of rumen bacteria

2.6 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃微生物门、属水平相对丰度的影响

图3展示了安格斯牛瘤胃门水平相对丰度前10的微生物菌门,在门水平上拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)是瘤胃微生物的优势菌门,占总相对丰度的80%以上。经过银杏叶粉饲喂后,G6和G9组瘤胃中的厚壁菌门相对丰度显著提高(P<0.05),而G3、G6和G9组瘤胃的螺旋菌门(Spirochaetota)相对丰度显著降低(P<0.05),其他菌门的相对丰度没有发生显著改变。
图3 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃微生物门水平上组成和差异的影响

注:*表示在P<0.05水平差异显著。网络版为彩图。

Fig.3 Effects of Ginkgo biloba powder supplementation on the composition and difference of the bacterial phylum level in rumen of Angus cattle

在属水平上,分析相对丰度排名前20的瘤胃微生物菌属。如图4所示,普雷沃菌属(Prevotella)为主要优势菌属。其中,G3、G6、G9和G12组瘤胃中未分类的F082科(F082_unclassified)相对丰度与Con组相比显著下降(P<0.05),G3、G12组瘤胃中未分类的颤螺菌科(Oscillospiraceae_unclassified)和G6组未分类的Paludibacter科(Paludibacter_unclassified)相对丰度显著降低(P<0.05),G9组中瘤胃琥珀酸菌属(Succiniclasticum)相对丰度显著升高(P<0.05),G12组RFP12菌科UBA1067(RFP12 UBA1067)的相对丰度显著上升(P<0.05),其他菌属的相对丰度与Con组相比无显著变化。
图4 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃微生物属水平上组成和差异的影响

注:*表示在P<0.05水平差异显著。网络版为彩图。

Fig.4 Effects of Ginkgo biloba powder supplementation on the composition and difference of the bacterial genus level in rumen of Angus cattle

2.7 瘤胃微生物功能预测

利用PICRUSt对微生物功能进行预测,在KEGG-pathway level3水平上预测了382种与瘤胃微生物相关的功能类别。图5a展示了前10个预测出的微生物功能,其中大多数微生物功能都与代谢相关,例如D-丙氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等。
图5 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃微生物功能的影响

注:网络版为彩图。

Fig.5 Effects of Ginkgo biloba powder on rumen bacterial function of Angus cattle

在所有预测出的微生物功能中,鉴定出8个具有显著差异的功能,如图5b所示。将这些差异显著的代谢通路进行整合,主要集中在氨基酸代谢、辅因子与维生素代谢、其他次生代谢物生物合成以及细胞生长和死亡方面,且G9组与这些代谢通路相关的功能基因丰度与Con组相比具有显著改变(P<0.05)。

2.8 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃代谢物的影响

进一步利用代谢组学分析饲喂银杏叶粉对安格斯牛瘤胃代谢物的影响。建立各处理组与Con组比较的PLS-DA模型,如图6所示,可以看出同组样本聚集在一起,不同组样本清晰分开,说明实验数据重复性较好,组间存在差异。
图6 PLS-DA得分图

Fig.6 PLS-DA score plot

通过统计分析和PLS-DA获得VIP值,选取VIP>1、P<0.05作为组间有显著差异的代谢物。在正离子模式下共筛选出36个具有显著差异的代谢物。表7为正离子模式下VIP值排名前10的差异代谢物,主要为脂肪酸、有机酸、糖类和多酚。与Con组相比,G6、G9组瘤胃中脂肪酸的含量显著降低(P<0.05),而甾醇脂类、有机酸、糖类、多酚类、有机氮化合物的含量显著升高(P<0.05)。负离子模式下共筛选出23种差异代谢物,表8为负离子模式下VIP值排名前10的差异代谢物。G6、G9组的瘤胃中二嗪和有机氧化合物的含量比Con组显著降低(P<0.05),其他代谢物含量比Con组显著升高(P<0.05)。
表7 正离子模式下组间差异代谢物对比分析(前10)

Tab.7 Comparative analysis of differential metabolites between groups in positive ion mode(top 10)

代谢物 生物角色 组 别 VIP P值
Con G3 G6 G9 G12
胆固醇酯 甾醇脂类 1.58b 2.57a 3.07a 3.20a 1.26b 2.82 <0.01
N-乙酰缬氨酸 有机酸 2.23c 3.28b 3.56b 4.36a 3.33b 2.81 <0.01
(9Z,11E,13S,15Z)-13-羟
基十八烷-9,11,15-三烯酸		 脂肪酸 14.64a 8.82bc 7.58c 7.01c 12.93ab 2.39 <0.01
1-(3,4-二甲氧基苯基)-乙酮肟 其他 0.24b 0.36a 0.37a 0.39a 0.32ab 2.37 0.02
油酸乙酯 脂肪酸 0.21ab 0.16ab 0.11c 0.09c 0.24a 2.37 0.03
异丙基β-D-吡喃葡萄糖苷 碳水化合物 0.07b 0.93a 0.97a 1.28a 0.80ab 2.32 0.04
1,7-双(4-羟基苯基)-3-庚酮 多酚类物质 0.24c 0.40b 0.61a 0.68a 0.33bc 2.22 <0.01
四醇-12R-HETE 其他 3.61c 12.68c 21.74bc 39.62ab 51.12a 2.20 <0.01
N-丁基-2-甲基-5-(哌
啶基磺酰基)-3-呋喃酰胺		 其他 1.19b 1.21b 1.48a 1.48a 1.27ab 2.15 0.04
4-氧代-4-[(1-苯乙
基)氨基]丁-2-烯酸		 有机氮化合物 4.09c 4.03c 8.28ab 10.02a 5.96bc 2.14 0.04

注:VIP为变量投影重要性。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表8 负离子模式下组间差异代谢物对比分析(前10)

Tab.8 Comparative analysis of differential metabolites between groups in negative ion mode(top 10)

代谢物 生物角色 组 别 VIP P值
Con G3 G6 G9 G12
8-异-15-酮前列腺素E2 激素和递质类 0.10d 0.45c 0.93a 0.65b 0.15d 3.87 <0.01
6-十五酰基水杨酸 苯及其取代衍生物 0.03c 0.53bc 0.94ab 1.53a 1.56a 3.09 <0.01
20-羟基二十碳四烯酸 脂肪酸 0.10c 1.99bc 3.10b 6.18a 6.11a 3.00 <0.01
玉米赤霉醇 大环内酯类和类似物 3.05c 11.02bc 21.68ab 35.33a 37.97a 2.66 <0.01
7-酮胆酸 类固醇 0.02c 0.09c 0.17b 0.30ab 0.40a 2.54 <0.01
戊二酸 羧酸及其衍生物 13.03b 24.64a 25.65a 25.05a 17.98ab 2.54 0.01
乳清酸 二嗪 0.32a 0.30ab 0.18c 0.19bc 0.30ab 2.46 0.02
L-阿拉伯糖醇 有机氧化合物 0.39a 0.29ab 0.08b 0.10b 0.19ab 2.32 <0.01
乌头酸 萜类化合物 74.41b 73.49b 88.91a 90.27a 67.62b 2.21 0.04
17(S)-HP二氢乙酸 脂肪酸 0.03c 0.06c 0.13b 0.23ab 0.31a 2.17 <0.01

注:VIP为变量投影重要性。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.9 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃代谢通路分析

图7为正、负离子模式下差异代谢物的KEGG通路富集图,由图可知,在正离子模式下,安格斯牛瘤胃的差异代谢物显著富集在精氨酸和脯氨酸代谢、咖啡因代谢、组氨酸代谢和β-丙氨酸代谢通路(P<0.05)。在负离子模式下,其在类固醇激素生物合成、萜类骨架生物合成、戊糖和糖醛酸转化通路显著富集(P<0.05)。
图7 正、负离子模式下差异代谢物KEGG通路富集

注:网络版为彩图。

Fig.7 Difference metabolite KEGG pathway enrichment under positive and negative ion mode

3 讨论

3.1 银杏叶粉对安格斯牛生长性能和表观消化率的影响

银杏叶及其提取物含有多种活性成分,能不同程度地影响机体的新陈代谢,促进动物的生长发育,改善动物的生产性能[20]。Niu等[21]将发酵银杏叶添加到肉鸡的基础日粮中,对肉鸡的生产性能有一定提升,添加3.5 g/kg发酵银杏叶可以显著提升肉鸡的平均日增重和平均日采食量。 胡高杰等[22]在绵羊日粮中添加银杏叶粉,降低了绵羊的日采食量和生长速度。在本研究中,添加银杏叶粉对安格斯牛的日增重有提升,但没有显著差异。银杏叶粉添加增加了安格斯牛的采食量,可能原因是饲喂的青贮味道掩盖了一部分银杏叶粉的苦味,银杏叶粉促进了安格斯牛瘤胃和肠道对食物的吸收,降低了饱腹感,从而增加了安格斯牛的采食量。总体来讲,银杏叶粉的添加对安格斯牛的生长性能有一定提高,有望成为新型的饲料添加剂。
在动物饲喂过程中,添加植物提取物能够刺激胃肠道产生更多消化酶,提高消化酶活性,使胃肠道微生物区系得到改善,提高机体对饲料中营养物质的利用率[23]。银杏黄酮是银杏叶中的重要活性成分,有研究证明黄酮类物质在体内可被快速吸收,刺激瘤胃产生多种蛋白质分解菌,这些蛋白质分解菌能够将日粮中更多的粗蛋白降解产生微生物蛋白,提高反刍动物对粗蛋白的利用率[24]。本研究中,饲喂银杏叶粉提高了G6和G9组安格斯牛的粗蛋白消化率,其可能与银杏叶中的黄酮类物质有关。反刍动物中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维消化率与其瘤胃消化机能有很大联系,中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率越高,对生长性能的提高也就越大[25]。也有报道指出干物质采食量和中性洗涤纤维的消化率正相关[26]。本研究中饲喂银杏叶粉后,G6与G9组安格斯牛的干物质采食量显著上升,与之对应的中性洗涤纤维消化率也显著上升,但日增重没有显著变化,可能因为正式实验期较短,实验前期各组差异较小,导致整体平均日增重未达到显著水平。本研究也发现银杏叶粉提高了G6与G9组安格斯牛酸性洗涤纤维的消化率,可能是银杏叶粉活性物质增加了与纤维降解相关酶的分泌量,也诱导了这些酶活性的提升,提高了琥珀酸拟杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的相对丰度,从而提高了瘤胃对纤维素的降解率[27]。

3.2 银杏叶粉对安格斯牛血清生化指标和抗氧化指标的影响

血液是机体与外界环境以及体内各组织之间进行物质交换的枢纽,是机体内环境的重要组成,能够反映动物的营养和健康水平[28]。甘油三酯是体内含量最多的脂类,能在一定情况下反映机体的脂质代谢状况[29]。有研究证实将银杏叶与他汀类药物联合使用可以降低血脂异常患者的血清总胆固醇和甘油三脂水平,对改善血脂有很好的效果[30]。在本研究中,与Con组相比,G9和G12组的血清甘油三脂含量显著降低,这与彭亮等[31]的研究结果一致,日粮中添加银杏叶粉对调节血脂具有积极作用。血清中的Ca2+在调节血管收缩和舒张过程中发挥作用,其主要原理是银杏叶提取物通过提高血管内皮细胞Ca2+浓度,增强一氧化氮合酶活性并促进一氧化氮的生成和释放来舒张血管[32]。在本研究中,日粮中添加银杏叶粉提高了血液中Ca2+的浓度,表明银杏叶粉可以起到舒张血管的作用。
活性氧的过度积累会引起反刍动物氧化应激[33]。降低活性氧,提高动物的抗氧化能力至关重要。谷胱甘肽过氧化物酶是一种重要的过氧化物酶,其活性可以间接反映自由基清除能力。谷胱甘肽过氧化物酶水平越高,过氧化物对身体的伤害越小。血清活性氧水平和总抗氧化能力反映了机体对自由基代谢物的抗氧化能力,并用于评估动物的机体抗氧化状态[34]。在本研究中,饲喂银杏叶粉显著提高了G9组的血清总抗氧化能力,说明日粮中添加银杏叶粉可以提高安格斯牛部分抗氧化酶的活性。此外,与Con组相比,G6、G9和G12组血清的丙二醛浓度显著降低,丙二醛是活性氧降解体内多不饱和脂质的产物,是反映氧化应激的生物标志物[35]。银杏叶提高动物的抗氧化能力与银杏叶中的活性成分有关,银杏黄酮中活跃的氢质子能够与自由基结合形成稳定的化合物,从而阻止其自动氧化过程[36]。安格斯牛抗氧化性能的提高,有利于机体健康,提高其生长性能。

3.3 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃发酵参数的影响

pH值影响瘤胃微生物的生长、演变和稳定性,是影响瘤胃发酵效率的关键因素[37]。肉牛瘤胃pH值在5.5~7.5为正常水平[38],本研究中瘤胃液pH值始终保持在6.8~7.2,银杏叶粉添加没有显著改变瘤胃pH值。氨态氮能为瘤胃微生物发酵提供氮源,影响微生物活性,适宜的氨态氮水平是保证微生物蛋白合成效率的首要条件[39]。本研究中,各组的氨态氮水平没有显著差异。反刍动物瘤胃对养分的吸收以及微生物动力学可产生大量挥发性脂肪酸,为反刍动物机体提供70%~80%的能量需求,其中乙酸、丙酸和丁酸约占瘤胃挥发性脂肪酸的95%[40]。在本研究中,与Con组相比,G6和G9组的乙酸比例下降,丙酸比例上升,银杏叶粉添加可能使瘤胃产生更少的甲烷,因为丙酸浓度升高可以结合更多氢,使甲烷产量降低[41-42]。G3组丁酸比例比Con组升高,这与前人研究结果一致[14]。综上,银杏叶粉添加可以在一定程度上促进瘤胃发酵,改变瘤胃中挥发性脂肪酸的比例。

3.4 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃微生物区系的影响

反刍动物瘤胃内微生物种类繁多,这些微生物协同配合将食入的饲料降解供机体吸收和利用,因此反刍动物的健康和高效生产依赖于瘤胃微生物生态系统的平衡[43]。本研究对瘤胃微生物的组成和多样性进行16S rRNA测序,结果显示各组间瘤胃微生物群落未显著分开,且安格斯牛瘤胃菌群的α多样性无显著差异,日粮添加银杏叶粉并未改变安格斯牛瘤胃菌群的组成和结构。许多动物实验已表明,拟杆菌门和厚壁菌门在微生物群落中占主导地位[44]。本研究结果显示,拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度达到80%以上,为瘤胃微生物的优势菌门,与前人研究结果一致[45]。厚壁菌门的主要作用是分解食物中的粗纤维,并将其转化为短链脂肪酸,其对丁酸盐的产生至关重要[46-47]。本研究中,饲喂银杏叶粉提高了G6和G9组瘤胃中厚壁菌门的相对丰度,它们可以提高瘤胃中丁酸盐的浓度,可能对瘤胃和网状上皮的增殖有益[48]。螺旋菌门是瘤胃微生物群落中普遍存在的成员之一,主要参与瘤胃中木聚糖和其他半纤维素的降解,并在挥发性脂肪酸的产生中发挥关键作用[49-50]。
本研究中,普雷沃菌属(Prevotella)是瘤胃相对丰度最高的属,与先前研究结果一致[51]。普雷沃菌属在瘤胃微生物群落遗传和代谢中发挥重要作用[52]。在排名前20的瘤胃微生物菌属中,银杏叶粉添加使瘤胃中5个菌属产生显著差异,其中F082_unclassified、 Oscillospiraceae_unclassified和Paludibacter_unclassified有所下降,而琥珀酸菌属和RFP12 UBA1067上升。F082_unclassified属于拟杆菌属,能通过分泌多种酶降解植物多糖,并产生挥发性脂肪酸[53]。琥珀酸菌属能与产甲烷菌竞争氢气产生琥珀酸盐,然后定量发酵产生丙酸盐,使瘤胃中丙酸盐含量上升[54]。有研究表明,琥珀酸菌属含量上升能提高平均日增重[55],降低产甲烷菌的丰度和甲烷含量[56]。Paludibacter在碳循环中发挥重要功能,它可以利用各种可溶性碳水化合物和单糖,生产短链脂肪酸[57]。本研究中Paludibacter_unclassified菌属的相对丰度有所降低,可能原因是瘤胃中有其他菌属共同竞争碳水化合物,导致其丰度下降。Oscillospiraceae是一种重要的丁酸盐生产者,能够利用葡萄糖酸盐或者碳水化合物发酵产生丁酸盐,在人类肥胖相关代谢中发挥重要作用[58]。RFP12菌科的特征至今还不是特别明确,但越来越多的人认为RFP12菌科是牛和羊瘤胃中的关键菌科,且在食草动物消化过程中发挥关键作用[59]。这些结果表明,银杏叶粉能够提高瘤胃中产丙酸相关微生物的相对丰度。

3.5 银杏叶粉对安格斯牛瘤胃代谢组学的影响

瘤胃代谢物的组成可以直接反映日粮营养物质在瘤胃内参与微生物代谢的规律。本研究通过代谢组学分析银杏叶粉对安格斯牛瘤胃代谢组的影响,PLS-DA结果显示,各处理组与Con组的代谢物组成明显分开,银杏叶粉显著改变了瘤胃代谢物组成。对代谢物进行筛选,发现主要的差异代谢物是脂肪酸类和类固醇类,对差异代谢通路进行分析发现,日粮中添加银杏叶粉改变了精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、类固醇激素生物合成、萜类骨架生物合成、戊糖和糖醛酸转化等代谢通路。精氨酸、脯氨酸和组氨酸都是二肽,它们是蛋白质消化和分解代谢的不完全产物,其中,精氨酸和脯氨酸的代谢密切相关,在精氨酸酶的作用下,精氨酸可分解为鸟氨酸和尿素,是尿素循环的一部分,而脯氨酸由谷氨酸生成,经过一系列酶的催化,最终转化为丙酮酸进入三羧酸循环。有研究发现,在菌群失调的情况下,脯氨酸在胃肠道微生物群重新平衡中发挥重要作用[60]。组氨酸在机体新陈代谢中发挥重要作用,它参与蛋白质合成,能脱羧基生成组胺进而参与许多生理过程[61]。β-丙氨酸不参与蛋白质合成,它能在酶的作用下产生肌肽和丙二酰半醛,丙二酰半醛可以进一步转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环或者脱羧生成乙醛,最终代谢生成乙酸盐[62]。类固醇激素在机体内发挥信号分子的作用,调节水盐平衡和糖脂代谢,在维持第二性征方面发挥作用[63],研究表明类固醇激素生物合成通路代谢物在反刍动物各消化道均广泛存在,可作为区分不同消化道区域微生物组特征的生物标志物[64]。戊糖和糖醛酸转化是重要的碳水化合物代谢途径,在糖异生和转胺等生物合成途径中发挥重要作用。综上,日粮添加银杏叶粉改善了肉牛瘤胃的氨基酸代谢,促进了营养物质的吸收利用,具有改善瘤胃功能的作用。

4 结论

日粮中添加银杏叶粉对安格斯牛的平均日增重有一定提升,添加量为6%和9%时其日增重较大,且粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化率显著提高。银杏叶粉添加量为9%时能够降低安格斯牛血清中的甘油三脂含量,在调节血脂方面发挥积极作用;同时能提高总抗氧化能力,并降低丙二醛的含量,提高机体抗氧化能力。日粮中银杏叶粉添加量为6%和9%时可以降低安格斯牛瘤胃中的乙酸含量,提高丙酸含量,改变瘤胃发酵。此外,银杏叶粉可以改变安格斯牛瘤胃微生物在门和属水平上的相对丰度,添加9%的银杏叶粉可以提高与产丙酸相关微生物的相对丰度。银杏叶粉还影响瘤胃代谢物的组成,这些代谢物通过影响精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、类固醇激素合成、萜类骨架合成、戊糖和糖醛酸转化等通路影响安格斯牛瘤胃代谢。综合以上结果,建议银杏叶粉的最适添加量为6%~9%。

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