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2024 , Vol. 52 >Issue 5: 71 - 81

DOI: https://doi.org/10.15983/j.cnki.jsnu.2024226

功能化合物应用研究

异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米纤维膜的制备表征及其愈伤作用

  • 何紫妍 ,
  • 张萌 ,
  • 贾颖宇 ,
  • 杨胜薇 ,
  • 骆莹 ,
  • 王晓宇 ,
  • 袁莉 , *
展开
  • 陕西师范大学 食品工程与营养科学学院,陕西 西安 710119
*袁莉,女,教授,硕士生导师,主要从事食品营养与安全研究。E-mail:

Copy editor: 焦阳

收稿日期: 2024-01-29

  网络出版日期: 2024-09-27

基金资助

国家自然科学基金(31972183)

陕西省技术创新引导专项(2022QFY09-03)

西安市科技计划项目(21XJZZ0008)

收起

The effect of isoorientin-zein/Arabic gum composite nanofiber membrane on wound healing in mice

  • HE Ziyan ,
  • ZHANG Meng ,
  • JIA Yingyu ,
  • YANG Shengwei ,
  • LUO Ying ,
  • WANG Xiaoyu ,
  • YUAN Li , *
Expand
  • School of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, Shaanxi, China

Received date: 2024-01-29

  Online published: 2024-09-27

Fold

摘要

为探究异荭草素(isoorientin,ISO)与玉米醇溶蛋白(zein)/阿拉伯胶(Arabic gum,GA)制得的复合纳米纤维膜对小鼠皮肤损伤愈合的影响,以空白纺丝膜为对照,分别使用负载zein/GA的纳米纤维膜、负载ISO的纳米纤维膜以及负载ISO-zein/GA的复合纳米纤维膜对小鼠伤口进行敷料处理。结果表明,负载zein/GA的纳米纤维膜、负载ISO的纳米纤维膜以及负载ISO-zein/GA的复合纳米纤维膜对小鼠的伤口愈合具有促进作用,可以有效减少伤口氧化损伤及促炎因子TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA表达水平,并促进伤口血管重建,从而加速伤口愈合。研究结果验证了异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶复合纳米纤维膜对伤口愈合的促进作用,拓宽了异荭草素的应用范围,为新型伤口敷料的研究提供了思路。

关键词： 异荭草素; 伤口愈合; 静电纺丝; 玉米醇溶蛋白; 纳米纤维膜

本文引用格式

何紫妍 , 张萌 , 贾颖宇 , 杨胜薇 , 骆莹 , 王晓宇 , 袁莉 . 异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶纳米纤维膜的制备表征及其愈伤作用[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2024 , 52(5) : 71 -81 . DOI: 10.15983/j.cnki.jsnu.2024226

Abstract

To investigate the effect of composite nanofiber membrane prepared from isoorientin (ISO) and zein/Arabic gum (GA) on skin injury healing in mice, this study used blank spinning membrane as control, and wound dressings were applied to mice using zein/GA loaded nanofiber membrane, ISO loaded nanofiber membrane, and ISO-zein/GA loaded composite nanofiber membrane, respectively. The results showed that the nanofiber membranes loaded with zein/GA, ISO and ISO-zein/GA had promoting effects on wound healing in mice. They effectively reduced wound oxidative damage and mRNA expression levels of pro-inflammatory factors(TNF-α、IL-1β、iNOS), and promoted wound vascular reconstruction, thereby accelerating wound healing. The research results verify the promoting effect of ISO-zein/GA composite nanofiber membrane on wound healing, expand the application range of isoorientin, and provide ideas for the research of new wound dressing.

Key words： isoorientin; wound healing; electrospinning; zein; nanofiber membrane

异荭草素(isoorientin, ISO)是一种C-葡萄糖基黄酮类化合物,广泛存在于荭草、荞麦、山楂、玉米、黄瓜等食物中,具有抗菌抗炎、降低氧化损伤等活性[1]。Wedler等在3T3瑞士白化小鼠成纤维细胞伤口愈合研究中发现,使用10 μmol/L的异荭草素对伤口进行处理,在处理12 h和24 h时伤口闭合度分别提高29%和56% [2],表明ISO有利于伤口愈合。
静电纺丝技术是对纺丝聚合物溶液或熔体施加强电场,使之在电场作用下喷射纺丝,制造纳米纤维的技术[3]。静电纺丝纳米纤维具有高比表面积、高空隙率等优点[4],且静电纺丝纳米纤维与人体的细胞外基质空间结构相似,可以模拟原生皮肤细胞外基质的三维结构,为伤口愈合提供完美微环境[5⇓-7],同时还能发挥良好的抗菌作用[8]。因此,近年来静电纺丝技术在伤口愈合方面的应用研究较为广泛。例如,李兴泽研究发现,含有5%芝麻酚的复合纳米纤维膜能够有效提高糖尿病小鼠的伤口愈合速率[9];Jeckson等构建的去铁胺负载的双层纳米纤维毡也具有伤口愈合潜能[10]。目前,负载ISO的纳米纤维膜对伤口愈合的作用尚不明确。
本研究采用静电纺丝技术,以聚丙烯腈(polyacrylonitrile,PAN)为原料,分别制备空白纳米纤维膜(PAN)、玉米醇溶蛋白(zein)与阿拉伯胶(Arabic gum,GA)复合纳米纤维膜(PAN-zein/GA)、负载ISO的纳米纤维膜(PAN-ISO)、负载ISO的zein/GA复合纳米纤维膜(PAN-ISO-zein/GA)。构建小鼠表面创伤模型,进行纳米纤维膜敷料处理,通过伤口愈合率测定、免疫组化分析、H&E与Masson染色等考察伤口愈合情况,并测定氧化指标及炎性因子与胶原蛋白的mRNA水平,考察伤口愈合质量,探究负载ISO复合纳米纤维膜对伤口愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

聚丙烯腈(PAN)、阿拉伯胶(GA)、玉米醇溶蛋白(zein)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海),异荭草素(ISO)购自成都植标化纯生物有限公司(四川成都)。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢(H2O2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所(江苏南京);总RNA提取试剂盒,生工生物工程有限公司(上海);Transscript all-in-one first strand cDNA synthesis supermix和PerfectstartTM green qPCR supermix,北京全式金生物科技有限公司(北京)。所用其他化学品均为分析级。

1.2 仪器与设备

F6/10-10G自动均质器,FLUKO测试仪器(上海)有限公司;SU8220扫描电子显微镜,日本日立公司;傅里叶红外分光光度计,德国布鲁克公司;SYBR Green system倒置显微镜,美国BIO-RAD公司;FC5718R高速冷冻离心机,美国AHOUS公司。

1.3 纳米纤维膜的制备和表征

1.3.1 纳米纤维膜的制备

分别配制PAN纺丝液,zein/GA与PAN混合纺丝液,0.5 mg/mL ISO与PAN混合纺丝液,1.0 mg/mL ISO与PAN混合纺丝液,0.5 mg/mL ISO、zein/GA与PAN混合纺丝液以及1.0 mg/mL ISO、zein/GA与PAN混合纺丝液。将配好的纺丝液装入5 mL注射器,针头内径0.41 mm,电纺针头接电源正极,收集器接电源负极,调整针头与收集器之间的距离为17 cm,电压为18 kV,推注流速为1 mL/h。纺丝结束后将纳米纤维膜在60 ℃烘箱内干燥,常温密封保存。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)表征

室温下,对样品进行傅里叶变换红外光谱表征。将PAN、PAN-ISO(1.0 mg/mL)、PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA压于载玻片上,用傅里叶红外分光光度计(4 000~400 cm-1)扫描样品。

1.3.3 水接触角的测定

将样品裁剪成2×2 cm2大小,平整地粘贴在载玻片上,在室内湿度50%的环境下使用水接触角测量仪测量水滴接触纤维膜10 s后的接触角。

1.3.4 扫描电子显微镜(SEM)观察

将制得的PAN、PAN-zein/GA、PAN-ISO(1.0 mg/mL)、PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA 4种纤维膜固定,经真空喷金处理后,在5 kV的加速电压下通过SEM观察并拍照。

1.4 动物实验

1.4.1 动物与分组

30只清洁级6~7周龄昆明雄性小鼠购自西安交通大学实验动物中心。小鼠在经过微粒空气过滤的、标准温度为25±2 ℃、光照-黑暗循环周期为12 h/12 h的环境内,自由摄入高压灭菌过的食物和水。适应1周后,对所有小鼠背部构建伤口直径为6~7 mm的圆形全皮肤层伤口模型。
将处理后的小鼠随机分为6组,分别为Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组,每组5只小鼠。
Control-PAN组小鼠伤口仅进行空白PAN纳米纤维膜敷料处理。PAN-zein/GA组小鼠伤口使用zein/GA复合纳米纤维膜进行敷料处理。PAN-ISO(0.5 mg/mL)组小鼠伤口使用负载0.5 mg/mL ISO的纳米纤维膜进行敷料处理。PAN-ISO(1.0 mg/mL)组小鼠伤口使用负载1.0 mg/mL ISO的纳米纤维膜进行敷料处理。PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组小鼠伤口使用负载0.5 mg/mL ISO的zein/GA复合纳米纤维膜进行敷料处理。PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组小鼠伤口使用负载1.0 mg/mL ISO的zein/GA复合纳米纤维膜进行敷料处理。每2 d更换1次敷料,测量小鼠的体重及伤口直径并拍照,计算伤口愈合率。连续10 d后,通过吸入异氟醚麻醉实验动物,称重后采取血液和创面皮肤组织样品。按L102/L02×100%公式计算伤口愈合率(L0代表第0天的伤口直径,L10代表第10天的伤口直径)。

1.4.2 皮肤组织病理观察

将皮肤组织用4%多聚甲醛缓冲液固定,包埋在石蜡中,切成厚度5~6 μm的切片,进行H&E染色与Masson染色,置于倒置显微镜下观察并拍照。

1.4.3 皮肤组织氧化指标的测定

使用自动均质器将皮肤组织匀浆后取上清,使用BCA分析试剂盒测量蛋白质浓度。根据试剂盒说明书,使用试剂盒测定过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的浓度。

1.4.4 皮肤组织免疫组化分析

对小鼠皮肤组织进行血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)与α-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)免疫组化分析。利用抗原与抗体特异性结合原理,使标记抗体的显色剂显色,从而确定组织细胞内CD31与ɑ-SMA并定量。样品送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行制片与分析,计算阳性细胞的相对密度。

1.4.5 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

根据说明书,使用RNA试剂盒提取总RNA,并使用Transscript all-in-one first strand cDNA synthesis supermix合成相应的cDNA。使用PerfectstartTM green qPCR supermix进行实时定量聚合酶链反应。通过SYBR Green system检测TNF-α、IL-1β、iNOS、TGF-β、Col1、Col3的转录。以GAPDH为内参,PCR反应程序为:94 ℃预变性30 s;94 ℃退火5 s,60 ℃延伸30 s,共40个循环。数据收集后,分析不同处理组中每个基因的相对表达水平。实验中所用引物信息如表1所示。
表1 实验中所用引物信息

Tab.1 Information of primers used in the experiments

基因 引物序列(3'-5') 长度/bp 引物信息
TGF-β TAATGGTGGACCGCAACAAC 171 NM_011577.2
CCACATGTTGCTCCACACTTGAT
IL-1β GCATCCAGCTTCAAATCTCGC 256 NM_008361.4
TGTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG
iNOS CAACAGGAACCTACCAGCTCACT 253 NM_001313921.1
AGCCTGAAGTCATGTTTGCCG
TNF-α ACCCTCACACTCACAAACC 212 NM_001278601.1
ATAGCAAATCGGCTGACGGT
Col1 TCCTGGCAAAGACGGACTCA 159 NM_007742.4?
GGCAGGAAGCTGAAGTCATAACC
Col3 TTTCTTCTCACCCTTCTTCATCC 131 NM_009930
CATATTTGACATGGTTCTGGCTTC

1.5 统计分析

所有结果均通过SPSS 19.0软件进行处理,数据以平均值±标准差进行表示。使用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s检验进行组间差异分析,P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米纤维膜的表征

如图1a所示,PAN-ISO(1.0 mg/mL)与PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA的红外光谱相似。PAN在2 200 cm-1附近出现—CN特征吸收峰,而PAN-ISO(1.0 mg/mL)与PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA中—CN特征峰消失,但在1 082 cm-1附近出现C—N特征峰;此外,二者还在1 650 cm-1处存在吸收峰,这是由C=O伸缩振动形成的。
图1 纳米纤维膜的表征

Fig.1 Characterization of nanofiber membranes

如图1b所示,4种纳米纤维膜的亲水性均良好,水接触角皆为0。
通过SEM对纳米纤维膜进行拍照(图1c)并计算纤维膜的平均直径,即纤维宽度。空白纳米纤维膜的平均直径为419.5 nm,负载zein/GA的纳米纤维膜平均直径为426.7 nm,负载ISO的纳米纤维膜平均直径为519.2 nm,ISO-zein/GA复合纳米纤维膜的平均直径为532.0 nm。在负载zein/GA、ISO和ISO-zein/GA后,纳米纤维膜的结构并未被破坏(图1d)。

2.2 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口愈合的影响

为探究ISO-zein/GA复合纳米纤维膜能否促进伤口愈合,构建小鼠表面创伤模型,记录0、2、4、6、8、10 d的伤口愈合情况(图2)并绘制伤口愈合率柱状图(图3)。结果显示,PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组和PAN-ISO (1.0 mg/mL)-zein/GA组小鼠的伤口愈合率均高于Control-PAN组。其中PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组小鼠的伤口愈合率最高,比Control-PAN组小鼠显著提高26.82%(P<0.05)。
图2 小鼠伤口愈合情况

注:网络版为彩图。

Fig.2 Wound healing status in mice

图3 小鼠伤口愈合率

注:不同小写字母代表在0.05水平差异显著。

Fig.3 Wound healing rates in mice

2.3 生理毒性检验

由图4可知,小鼠前8 d的体重先减后增,后因断水断食体重下降,证明敷料无生理毒性。
图4 小鼠体质量变化

Fig.4 Body weight changes of mice

2.4 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口组织的影响

对小鼠伤口皮肤组织进行H&E染色与Masson染色,结果如图5所示。可以看出,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组伤口组织结构完整,胶原纤维排列紧密,血管结构完整;PAN-ISO(0.5 mg/mL)组与PAN-zein/GA组伤口组织结构松散,尚未形成完整皮肤组织结构;Control-PAN组肉芽组织间隙结构松散,炎性因子浸润较多。
图5 创面皮肤组织染色图像

注:网络版为彩图。

Fig.5 Staining images of wound skin tissue

2.5 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口抗氧化性的影响

为探究ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口氧化损伤的影响,对伤口皮肤组织的3项常规氧化指标H2O2、MDA、GSH-Px进行检测(图6)。PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组H2O2与MDA水平均显著低于其他组(P<0.05),其中,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的H2O2质量摩尔浓度较Control-PAN组降低26.82%(P<0.05),MDA质量摩尔浓度较Control-PAN组降低59.09%(P<0.05),抗氧化酶GSH-Px活性较Control-PAN组和PAN-zein/GA组分别显著升高19.47%和8.49%(P<0.05)。从研究结果可以看出,负载zein/GA的纳米纤维膜、负载ISO的纳米纤维膜以及负载ISO-zein/GA的复合纳米纤维膜都能有效减轻伤口氧化损伤,但 PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组效果最佳。
图6 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口抗氧化性的影响

注:不同小写字母代表在0.05水平差异显著。

Fig.6 Effects of ISO-zein/GA composite nanofiber membranes on wound antioxidant activity

2.6 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口血管重建的影响

为探索ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对小鼠伤口处血管重建的影响,利用免疫组化检测小鼠伤口皮肤组织CD31的表达量,结果如图7所示,其中淡黄色代表弱阳性,棕黄色代表中阳性,棕褐色代表强阳性。
图7 CD31免疫组化染色结果

注:网络版为彩图。

Fig.7 Results of CD31 immunohistochemical staining

如图8所示,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的CD31阳性细胞密度显著高于Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组(P<0.05);其中,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的CD31阳性细胞密度较Control-PAN组与PAN-zein/GA组分别显著升高51.26%和37.33%(P<0.05)。此外,PAN-ISO(1.0 mg/mL)组的CD31阳性细胞密度高于Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组。
图8 CD31阳性细胞密度

注:不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

Fig.8 Positive cell density of CD31

以上结果表明,低剂量ISO对CD31的表达量无促进作用,而高剂量ISO纳米纤维膜和高剂量ISO-zein/GA复合纳米纤维膜能够促进伤口组织内的血管重建。

2.7 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口TGF-β信号通路的影响

为探究ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对小鼠伤口处TGF-β信号通路的影响,利用免疫组化检测小鼠伤口皮肤组织α-SMA的阳性细胞密度,并测定TGF-β mRNA的相对表达量,结果如图9所示。Control-PAN组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组与PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的α-SMA阳性细胞密度显著高于PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组(P<0.05),其中,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的α-SMA阳性细胞密度较PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组分别显著升高61.53%、49.99%和60.17%(P<0.05)。PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的TGF-β mRNA表达水平较Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组分别显著升高66.04%、29.72%、71.43%、18.24%和53.17%(P<0.05)。
图9 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口TGF-β信号通路的影响

注:不同小写字母表示在0.05水平差异显著。网络版为彩图。

Fig.9 Effects of ISO-zein/GA composite nanofiber membranes on wound TGF-β signaling pathway

α-SMA免疫组化结果表明,尽管负载高剂量ISO的纳米纤维膜组小鼠伤口皮肤组织的α-SMA阳性细胞密度显著高于负载低剂量ISO的纳米纤维膜组小鼠,但与Control-PAN组相比并无显著差异,而mRNA结果中负载高剂量ISO的纳米纤维膜组小鼠伤口皮肤组织的TGF-β 表达量显著高于Control-PAN组。

2.8 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口炎症因子的影响

通过测定炎症因子TNF-α、iNOS、IL-1β的mRNA相对表达水平,探究ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口炎症因子的影响。如图10所示,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组的TNF-α mRNA相对表达水平显著低于Control-PAN组、PAN-zein/GA组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)组(P<0.05);PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组iNOS和IL-1β的mRNA相对表达水平显著低于Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组(P<0.05)。该结果表明负载高剂量ISO能够有效提高纳米纤维膜的抗炎活性。
图10 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对伤口炎症因子的影响

注:不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

Fig.10 Effects of ISO-zein/GA composite nanofiber membranes on wound inflammatory factors

2.9 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重建的影响

如图11所示,PAN-zein/GA组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组和PAN-ISO(0.5 mg/mL)组COL1的mRNA相对表达水平显著高于Control-PAN组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组(P<0.05);PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组COL3的mRNA表达水平较Control-PAN组、PAN-zein/GA组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)组、PAN-ISO(1.0 mg/mL)组、PAN-ISO(0.5 mg/mL)-zein/GA组分别显著升高134.96%、95.18%、134.59%、54.82%和72.28%(P<0.05);PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组COL1、COL3 mRNA相对表达水平的比值较PAN-zein/GA组显著降低64.51%(P<0.05)。该结果表明zein/GA能够显著提升COL1的表达,同时也会导致COL1、COL3表达水平的比值升高,而负载高剂量ISO能够有效抑制COL1的表达,提高COL3的表达。
图11 ISO-zein/GA复合纳米纤维膜对ECM重建的影响

注:不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

Fig.11 Effects of ISO-zein/GA composite nanofiber membranes on ECM reconstruction

3 讨论

伤口愈合是一个复杂的过程[11],主要包括止血、炎症、增殖和细胞外基质重建4个阶段[12]。维持湿润、透气、无菌的伤口环境是促进伤口愈合的重要因素之一[13]。传统敷料多以纱布、棉麻为主,能起到一定的保护与抗菌作用,但不具有治疗伤口感染、促进伤口愈合的功能[14]。理想的伤口敷料应具有加速伤口愈合、维持创面湿润、允许气体交换以及防止伤口感染等优势。随着静电纺丝技术的发展,其形成的纳米纤维膜在医用敷料领域的应用得到广泛研究。
玉米醇溶蛋白是天然植物大分子,其构成的静电纺丝膜具有良好的安全性。本研究中,各组小鼠体重趋势一致,构建伤口模型前2 d体重下降,后期随着伤口的愈合体重逐步上升,也验证了负载ISO的zein/GA静电纺丝膜无生理毒性,但其长期的伤口愈合安全性还有待进一步验证。1962年,Winter发现保持伤口湿润有利于伤口愈合[15],以此为基础,新型伤口敷料相关研究不断发展。在本研究中,4种纳米纤维膜都具有良好的亲水性,有利于保持伤口环境湿润,促进伤口愈合。
伤口愈合过程中,中性粒细胞与巨噬细胞等会在伤口处释放促炎细胞因子、趋化因子与活性氧,并通过吞噬与产生自由基协助伤口愈合[16-17],而过量的自由基会引起氧化应激,造成氧化损伤,推迟伤口愈合[18]。ISO能够降低氧化损伤[19],本研究通过对常见抗氧化物GSH-Px[20]、氧化损伤标志物MDA[21]以及常见自由基H2O2[22]进行检测也发现,与空白纳米纤维膜相比,负载zein/GA与ISO都能提高纤维膜的抗氧化损伤功能;而与单独负载zein/GA相比,负载1.0 mg/mL ISO-zein/GA的复合纳米纤维膜效果最佳。伤口愈合初期,伤口会出现适当炎症,中性粒细胞、巨噬细胞等清除损伤因子后,炎症会消退[23]。当中性粒细胞与巨噬细胞持续浸润伤口,炎症长期不消退,就会阻碍伤口肌成纤维细胞以及ECM的重建[24]。多项研究表明,ISO具有良好的抗炎作用[1]。本实验通过对促炎因子TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA表达水平进行测定也发现,空白纳米纤维膜以及负载zein/GA的纳米纤维膜在负载1.0 mg/mL ISO后,能够更有效地抑制伤口炎症因子表达。
血管生成是伤口愈合的关键步骤[25]。CD31是新生血管内皮细胞表面标志[26],能够通过CD31的免疫组化了解组织内血管生成情况。本研究中,CD31免疫组化阳性细胞率结果表明,负载了1.0 mg/mL ISO的纳米纤维膜能够有效促进伤口组织内的血管重建。肌成纤维细胞及其所在的细胞外基质(ECM)是伤口愈合和纤维化的关键组成部分[27]。TGF-β信号通路是伤口愈合的关键信号通路,能够促进肌成纤维细胞的形成[28]。本研究中,PAN-ISO(1.0 mg/mL)-zein/GA组的TGF-β信号通路mRNA表达量显著高于其他组,证明高剂量ISO-zein/GA复合纳米纤维膜有利于促进伤口愈合。在伤口愈合前、中期,TGF-β信号通路会调控α-SMA,促进肌成纤维细胞的形成[27]。然而,在本研究中,Control-PAN组的α-SMA阳性细胞密度高于其他组,推测该结果的出现是因为Control-PAN组伤口愈合仍处于愈合中期,α-SMA表达活跃。zein能够有效提高Ⅰ型胶原蛋白的mRNA相对表达水平,同时也会提高Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的mRNA相对表达水平比例,ECM主要结构为Ⅰ型胶原蛋白与Ⅲ型胶原蛋白,其表达水平与比例对伤口ECM的重建均有影响,过高的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的mRNA相对表达水平比例会促进疤痕形成[27-28]。本研究发现,ISO能够有效抑制zein/GA纳米纤维膜对疤痕的形成。
与当前临床常用的纱布、止血绷带等传统敷料相比,ISO-zein/GA复合纳米纤维膜具有传统敷料所不具备的良好抗炎活性与抗氧化损伤活性,且具有推动血管重建以及抑制疤痕形成的功效。玉米醇溶蛋白是玉米淀粉加工的副产物,来源广泛、廉价易得[29],ISO在植物中广泛存在、便于提取[1],将二者用于生物活性物质敷料制作,降低了原料成本。

4 总结

本研究证明了异荭草素-玉米醇溶蛋白/阿拉伯胶复合纳米纤维膜能够通过减轻伤口氧化损伤、促进伤口血管重建、减少伤口炎症因子等途径有效促进伤口愈合。研究结果为新型伤口敷料的开发提供了思路,拓宽了异荭草素的应用范围,但异荭草素对TGB-β信号通路的具体影响机制及其长期功效还有待进一步探究。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
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袁莉, 王晓, 李庆舒, 等. 天然黄酮异荭草素研究进展[J]. 食品与生物技术学报, 2020, 39(7):21-27.

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